何海濤，丁西平，王金平，李燁

(1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，合肥230032；2廬江縣人民醫(yī)院；3廬江縣中醫(yī)院)

胃食管反流病(GERD)是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率有逐漸增高趨勢(shì)[1]，且隨年齡增加其患病率也上升。2014年中國(guó)GERD專(zhuān)家共識(shí)意見(jiàn)指出，質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)是治療GERD的首選藥物，療程應(yīng)至少維持8周以上。長(zhǎng)期應(yīng)用PPIs抑制胃酸分泌，可導(dǎo)致胃酸屏障功能降低，引起胃內(nèi)細(xì)菌定植和腸道菌群紊亂。目前，長(zhǎng)期使用PPIs對(duì)老年患者腸道菌群的影響尚無(wú)充分的臨床及基礎(chǔ)研究。2016年1月～2017年1月，我們使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析了43例老年GERD患者長(zhǎng)期使用PPIs后腸道菌群的變化?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集廬江縣人民醫(yī)院及安徽省立醫(yī)院長(zhǎng)期服用PPIs的老年GERD患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥60歲；②使用PPIs超過(guò)6個(gè)月；③BMI<24；④入選前3個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)任何抗生素及益生菌、益生元；⑤大便常規(guī)正常，無(wú)腹瀉、腹脹等腸道菌群紊亂表現(xiàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①GERD以外的其他急慢性胃腸道疾??；②急慢性感染；③合并內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病(糖尿病及肥胖等)；④伴有嚴(yán)重心腦血管病或全身感染性疾病或臟器功能衰竭等。共選取患者43例(研究組)，男32例、女11例，年齡(74.2±8.2)歲，基礎(chǔ)疾病為高血壓26例、冠心病15例、腦梗死13例、慢性阻塞性肺疾病9例；選擇同時(shí)期無(wú)GERD的老年患者35例(對(duì)照組)，男25例、女10例，年齡(74.8±9.2)，基礎(chǔ)疾病為高血壓19例、冠心病12例、腦梗死15例、慢性阻塞性肺疾病7例。兩組性別、年齡、基礎(chǔ)疾病具有可比性。研究組根據(jù)數(shù)字表隨機(jī)分為治療組及觀察組，治療組21例予以PPIs及雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊(申信宜)口服1個(gè)月，觀察組22例僅繼續(xù)口服PPIs。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 腸道菌群觀察方法 ①標(biāo)本采集：兩組納入后及研究組1個(gè)月后均留取中段大便1次(2 g以上)，使用無(wú)菌凍存管儲(chǔ)存，半小時(shí)內(nèi)放入-80 ℃冰箱凍存。②大便標(biāo)本DNA提?。喝?.3 g大便，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取大便細(xì)菌DNA，放入-80 ℃冰箱內(nèi)凍存。③引物設(shè)計(jì)與合成：參照相關(guān)文獻(xiàn)及報(bào)道，通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)不同引物的代表性和特異性，篩選出特異性強(qiáng)的引物，由上海生工生物公司合成，引物信息詳見(jiàn)表1。④DNA定量分析：將提取的DNA分別進(jìn)行7種細(xì)菌的16 S rDNA熒光定量PCR，每次實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品校正和ddH2O代替DNA模板的陰性對(duì)照，每個(gè)樣品均同時(shí)做2個(gè)平行復(fù)孔。反應(yīng)完畢后根據(jù)曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性。⑤反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件：優(yōu)化反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件，進(jìn)行SYBR Green為熒光染料的實(shí)時(shí)定量PCR；根據(jù)讀取的熒光數(shù)據(jù)，由系統(tǒng)軟件自動(dòng)分析循環(huán)閾值(Ct)，并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。菌群數(shù)量用log拷貝數(shù)/濕便重(g)表示。

表1 腸道7種目標(biāo)菌群的特異性引物序列

2 結(jié)果

2.1 PPIs對(duì)老年GRED患者腸道菌群的影響 與對(duì)照組比較，研究組大便中雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量減少(P均<0.05)，而葡萄球菌數(shù)量增加(P<0.01)；腸桿菌、腸球菌、大腸埃希菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按年齡層分析顯示，研究組60～69歲者大便中雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量減少(P均<0.05)，而葡萄球菌數(shù)量增加(P<0.05)；70～79歲者大便中雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量明顯減少(P均<0.05)；≥80歲者大便中雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量減少(P均<0.05)，而葡萄球菌及大腸埃希菌的數(shù)量增加(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 雙歧桿菌對(duì)長(zhǎng)期服用PPIs老年GRED患者腸道菌群的影響 治療組1個(gè)月后大便中雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量增加(P均<0.01)，而大腸埃希菌及葡萄球菌數(shù)量減少(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

3 討論

表2 PPIs對(duì)老年GRED患者腸道菌群定量的影響(logN/g濕便，

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.01。

表3 雙歧桿菌對(duì)長(zhǎng)期服用PPIs老年GRED患者腸道菌群定量的影響(logN/g濕便，

注：與本組基線比較，*P<0.05，#P<0.01；與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，△P<0.05，○P<0.01。

PPIs自上世紀(jì)80年代開(kāi)始應(yīng)用臨床以來(lái)，顯著地改善了胃酸分泌過(guò)多相關(guān)性胃疾病的臨床癥狀，對(duì)酸相關(guān)性胃疾病的治療具有重要意義。臨床上一直以來(lái)認(rèn)為，PPIs具有良好的療效和安全性，其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大；但是，近年來(lái)PPIs過(guò)度使用，包括超適應(yīng)證、超劑量、超療程等問(wèn)題日益突出，其長(zhǎng)期使用對(duì)人體的不利影響逐步受到重視[2]。

PPIs是老年人的常用藥物之一，老年患者常多病共存及多重用藥，藥物間相互作用、相互影響導(dǎo)致藥物的不良反應(yīng)發(fā)生率也相應(yīng)升高。因此，老年患者如何合理安全應(yīng)用PPIs也尤為重要。腸道菌群是由定居在腸道的微生物構(gòu)成，腸道微生物數(shù)量龐大，根據(jù)其對(duì)人體的作用可以分為有益菌、有害菌和中性菌。在正常情況下，腸道菌群保持著相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)；有益菌占總菌群總量約90%，包括雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌屬等；這些復(fù)雜的微生物系統(tǒng)共同組成了一個(gè)超級(jí)生物體，主要作用包括營(yíng)養(yǎng)與物質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)和生物屏障等[3]。細(xì)菌、宿主和環(huán)境三者之間相互依存、制約與影響，如三者之間平衡被打破則容易導(dǎo)致相關(guān)疾病發(fā)生[4]。研究[5，6]發(fā)現(xiàn)，老年人的腸道定植抗力下降，容易發(fā)生腸道菌群的失調(diào)；而PPIs可降低胃酸對(duì)外源性細(xì)菌的防御作用，導(dǎo)致外源性致病菌容易侵襲并定植在人體腸道內(nèi)，影響老年人腸道正常菌群的繁殖和生長(zhǎng)；改變老年人腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，增加感染機(jī)會(huì)。因此，務(wù)必要重視老年患者長(zhǎng)期應(yīng)用PPIs后腸道菌群變化及干預(yù)措施。

本研究通過(guò)對(duì)長(zhǎng)期使用PPIs老年患者的腸道菌群進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果顯示長(zhǎng)期使用PPIs的老年患者腸道雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量較對(duì)照組減少，而葡萄球菌數(shù)量增加；與Imhann等[7]研究結(jié)果一致；提示長(zhǎng)期使用PPIs可導(dǎo)致老年患者的腸道菌群紊亂，主要表現(xiàn)為有益菌數(shù)量減少而有害菌數(shù)量增加。因此，老年人腸道菌群紊亂可導(dǎo)致腸道炎癥性疾病及肺部、腹部炎癥性疾病等多種慢性炎癥及疾病。對(duì)于PPIs引起老年患者腸道菌群失調(diào)，其原因可能包括：首先，胃內(nèi)強(qiáng)酸環(huán)境不適合病原微生物乃至絕大多數(shù)微生物的生存，且老年人的胃酸分泌并不會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而降低；長(zhǎng)期應(yīng)用PPIs持續(xù)抑制胃酸分泌，導(dǎo)致胃內(nèi)pH值明顯升高、胃酸屏障功能降低，可引起胃內(nèi)細(xì)菌定植和腸道菌群過(guò)度生長(zhǎng)[8]。Bavishi等[9]認(rèn)為，應(yīng)用PPIs后引起的嚴(yán)重低胃酸可導(dǎo)致胃內(nèi)定植細(xì)菌增多，腸道有害菌易感性風(fēng)險(xiǎn)增加；同時(shí)，消化道與外界相通，必然與大量病原微生物接觸，易引起腸道菌群易位，增加腸道感染的風(fēng)險(xiǎn)[5]。其次，胃酸減少及胃內(nèi)pH值明顯升高，繼之胃蛋白酶原激活下降以及胰液、膽汁、腸液的分泌減少，導(dǎo)致腸道中未被吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，尤其是蛋白質(zhì)類(lèi)增加，為腸道有害細(xì)菌提供氮源促進(jìn)其生長(zhǎng)，影響老年人腸道菌群的穩(wěn)態(tài)[10]。老年患者各年齡段分析結(jié)果與老年患者整體情況一致，長(zhǎng)期使用PPIs可引起各年齡段老年患者腸道菌群失調(diào)；提示在老年各年齡段使用PPIs均應(yīng)該提高警惕。腸道菌群失調(diào)主要表現(xiàn)為腸道中雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量明顯下降，而在≥80歲的患者糞便中葡萄球菌及大腸埃希菌的數(shù)量明顯增加；提示長(zhǎng)期應(yīng)用PPIs的高齡患者腸道菌群失調(diào)較80歲以下老年患者嚴(yán)重，可能與高齡患者腸道蠕動(dòng)減少、腸道慢性炎癥及腸道衰老有關(guān)。因此，對(duì)于高齡患者長(zhǎng)期應(yīng)用PPIs應(yīng)慎重，并注意警惕腸道菌群紊亂引起的相關(guān)臨床癥狀。

Sheu等[11]認(rèn)為，在三聯(lián)抗幽門(mén)螺桿菌時(shí)使用抗生素及PPIs同時(shí)補(bǔ)充乳酸桿菌和雙歧桿菌，可改善抗生素和PPIs的應(yīng)用對(duì)胃腸道菌群的影響；并且，益生菌制劑對(duì)預(yù)防和治療老年重癥肺部感染中抗生素相關(guān)性腹瀉具有明顯療效[12]。腸道益生菌影響腸道微生物主要通過(guò)以下方面：增加腸道免疫力，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞分泌參與腸道的防御屏障，直接抑制腸道致病菌的侵襲[13]；造成厭氧菌生長(zhǎng)的微環(huán)境，促進(jìn)厭氧菌的生長(zhǎng)；產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，對(duì)大腸埃希菌、鏈球菌、難辨梭菌和沙門(mén)菌等多種致病菌發(fā)揮抑制作用[14]。乳酸桿菌屬及雙歧桿菌屬均是促進(jìn)人類(lèi)腸道健康的重要菌群。有研究[15]顯示，雙歧桿菌及乳酸桿菌減少可增高腸道的通透性，腸道通透性增高可使水、鈉吸收減少產(chǎn)生腹瀉；同時(shí)還能夠抑制大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌等致病菌的生長(zhǎng)，起到調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)的作用。本研究中，治療組服用PPIs同時(shí)予以雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊，1個(gè)月后腸道大便雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量增加，而大腸埃希菌及葡萄球菌數(shù)量減少，而觀察組腸道菌群無(wú)明顯變化；提示補(bǔ)充雙歧桿菌三聯(lián)活菌可明顯改善患者腸道菌群，糾正PPIs對(duì)老年患者腸道菌群的影響。因此，對(duì)于需要長(zhǎng)期服用PPIs的老年患者，可考慮同時(shí)予以補(bǔ)充腸道益生菌。

老年患者長(zhǎng)期使用PPIs易導(dǎo)致腸道菌群紊亂，對(duì)存在慢性基礎(chǔ)疾病的老年患者，應(yīng)權(quán)衡長(zhǎng)期PPIs治療的獲益和風(fēng)險(xiǎn)；對(duì)患有腸道功能紊亂及腸道感染的老年患者，應(yīng)嚴(yán)格控制PPIs治療的適應(yīng)證。對(duì)必須長(zhǎng)期使用PPIs的老年患者，在經(jīng)濟(jì)條件允許的情況下可考慮聯(lián)合使用腸道微生態(tài)制劑。但是，何時(shí)使用何種腸道微生態(tài)制劑對(duì)調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)最為有效，仍需進(jìn)一步研究。

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