程玉，薛晶，次云哲

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000)

胃癌在所有常見癌癥中發(fā)病率排名第4，且病死率排名第2[1]，闡明其發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制并有效指導(dǎo)臨床治療顯得尤為急迫。近年來，信號傳導(dǎo)異常改變成為胃癌發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。相鄰細(xì)胞間進(jìn)行直接信息交流的惟一通道為細(xì)胞間隙連接，間隙連接蛋白32(Cx32)是構(gòu)成胃黏膜間隙連接通道主要的結(jié)構(gòu)和功能蛋白[2]。磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)能調(diào)控許多與細(xì)胞代謝、凋亡、增殖和分化有關(guān)的蛋白，從而抑制細(xì)胞的凋亡，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長[3]。但是，這種細(xì)胞間信號傳導(dǎo)與細(xì)胞內(nèi)信號通路的相互影響，國內(nèi)外研究很少。本研究擬通過檢測正常胃黏膜與胃癌組織中Cx32與p-AKT的表達(dá)差異，探討二者的相互關(guān)系，為闡述胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2012年7月～ 2014年2月收治的胃癌初診患者60例，男45例、女15例，中位年齡56歲；腫瘤組織高、中分化24例，低分化26例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期32例；侵犯漿膜48例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例；術(shù)前均未行放、化療。患者均行胃癌切除術(shù)，均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)為胃腺癌，相應(yīng)癌旁組織均未見累及，另取30例正常胃黏膜(據(jù)癌灶邊緣10 cm以上)作為對照。所有標(biāo)本離體后分為兩份，一份離體后立即置于液氮中保存(用于Western blotting檢測)，另一份置于10%甲醛溶液中固定(用于免疫組化檢測)。

1.2 Cx32與p-AKT檢測方法

1.2.1 免疫組化Elivision法 將取材后的標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，脫蠟脫水，連續(xù)4 μm切片。嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，最后封片觀察。同時設(shè)立陰性及陽性對照。Cx32與p-AKT陽性染色細(xì)胞均呈棕黃色，用IPP圖像分析軟件分析免疫組化圖片。選取圖片上陽性染色的區(qū)域(AOI)，測定該區(qū)域的光密度(OD)值；選取并測量有效統(tǒng)計(jì)區(qū)域的面積，計(jì)算選擇區(qū)域內(nèi)的光密度平均值(IOD)，計(jì)算同一類型標(biāo)本切片各照片的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.2 Western blotting法 稱取適量組織(50～100 mg)并剪碎，加入約600 μL RIPA蛋白裂解液和5 μL PMSF蛋白保護(hù)液，BCA法測定蛋白濃度。灌制5%的濃縮膠和12%的分離膠，每泳道加總蛋白量80 μg進(jìn)行電泳分離；在穩(wěn)流狀態(tài)低溫下，將蛋白轉(zhuǎn)至聚乙烯二氟(PVDF)膜上。常溫封閉3 h，分別加入兔抗人Cx32(Bioword Technology公司)及p-AKT(Abcom公司)單克隆抗體(1∶10 000稀釋)和小鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶10 000稀釋)和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶3 000稀釋)，室溫孵育1 h，洗膜、顯影、定影。Cx32及p-AKT的相對表達(dá)量用Cx32/β-actin和p-AKT/β-actin灰度值表示，灰度采用IPP圖像分析軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測結(jié)果

2.1.1 Cx32和p-AKT在正常胃黏膜及胃癌組織中的表達(dá)及二者的相關(guān)性 Cx32在正常胃黏膜組織中陽性表達(dá)蛋白主要定位于細(xì)胞膜，而在癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。p-AKT陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)。與正常胃黏膜組織比較，胃癌組織中Cx32表達(dá)降低、p-AKT表達(dá)增高(P均<0.05)，且二者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.297，P<0.05 )。見表1。

表1 胃癌組織與正常胃黏膜組織中Cx32和p-AKT免疫組化檢測結(jié)果

2.1.2 Cx32和p-AKT表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表2。

表2 Cx32和p-AKT表達(dá)(免疫組化)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.2 Western blotting檢測結(jié)果

2.2.1 Cx32和 p-AKT在正常胃黏膜及胃癌組織中的表達(dá)及二者的相關(guān)性 與正常胃黏膜組織比較，胃癌組織中Cx32表達(dá)降低、p-AKT表達(dá)增高(P均<0.05)，且二者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.431，P<0.05 )。見表3。

表3 胃癌組織與正常胃黏膜組織中Cx32和p-AKT的Western blotting檢測結(jié)果

2.2.2 Cx32和p-AKT表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表4。

3 討論

由間隙連接蛋白β1基因編碼的Cx32，大量表達(dá)于哺乳動物的胃黏膜上皮；成熟黏膜內(nèi)的Cx32似乎能形成生物學(xué)的關(guān)鍵路徑，可增強(qiáng)細(xì)胞間電或者是新陳代謝的合作功能[4]。新近有研究[5,6]發(fā)現(xiàn)，Cx32參與了宮頸癌細(xì)胞的抗凋亡作用及肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。本研究結(jié)果顯示，Cx32在正常胃黏膜組織中陽性表達(dá)蛋白主要定位于細(xì)胞膜，而在癌組織中表達(dá)下調(diào)，且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜極少表達(dá)，從而間接證實(shí)了細(xì)胞癌變過程中存在間隙連接通訊功能障礙。本研究還發(fā)現(xiàn)，高、中分化胃癌組織中Cx32表達(dá)均高于低分化胃癌組織，TNM Ⅰ～Ⅱ期胃癌組織Cx32表達(dá)高于Ⅲ～Ⅳ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中Cx32表達(dá)低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。所以我們推測，Cx32可能參與了胃癌的發(fā)生，并影響了胃癌的生物學(xué)行為。Cx32 表達(dá)水平下降和間隙連接細(xì)胞間通訊功能異常，可能參與了胃癌惡性程度的進(jìn)展和腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

表4 Cx32和p-AKT表達(dá)(Western blotting)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

AKT信號傳導(dǎo)通路能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管形成、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲力等，促進(jìn)腫瘤演進(jìn)過程[7]。p-AKT可促進(jìn)不同腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力。例如：p-AKT通過增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶2活性，從而促進(jìn)小鼠乳腺癌上皮細(xì)胞的浸潤[8]；鱗狀細(xì)胞癌中，活化的p-AKT能促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，p-AKT在胃癌中的表達(dá)明顯高于正常胃組織，其表達(dá)與胃癌患者的性別、年齡無關(guān)，隨著胃癌分化程度的降低而增高，隨著胃癌TNM分期的增高而增高，且侵犯漿膜及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)增高。這些現(xiàn)象提示，p-AKT在胃癌組織中表達(dá)增高，其高表達(dá)可能與胃癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)系。

本研究還發(fā)現(xiàn)，胃癌組織Cx32的表達(dá)降低而p-AKT表達(dá)增高，并且Cx32與p-AKT的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這種現(xiàn)象可能是通過p-AKT自身磷酸化或者是通過對多種信號傳導(dǎo)分子的激活，從而啟動Cx32的磷酸化，最終破壞了細(xì)胞間隙連接通訊，細(xì)胞之間相互控制能力減弱，細(xì)胞能夠過分地克隆、生長[10]。Zhao等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Cx32可通過p53及AKT信號通路調(diào)控肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖。但是，Cx32能否通過AKT信號通路影響胃癌的生物學(xué)功能，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)Cx32和p-AKT的表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，二者在胃癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，推測二者在胃癌生物學(xué)行為中可能具有相互抑制作用。但是本研究樣本量較少，并且只是停留在組織層面。本課題組將進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞及動物試驗(yàn)，更深層次地探討二者在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的相互關(guān)系，為胃癌發(fā)病機(jī)制的研究提供新思路。

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