李娜，趙穎，張曉杰，李偉寧

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250355；2 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

銀屑病是T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥疾病，特征是表皮增生、角化過(guò)度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及血管形成增加[1，2]，全球患病率為2%～3%[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)家族中以VEGF-A為主，常以其水平表示VEGF水平，其受體主要包括VEGFR1、VEGFR2。研究表明[4～6],銀屑病患者血清VEGF水平與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，VEGF誘導(dǎo)的血管異常生成被認(rèn)為是銀屑病發(fā)病機(jī)制之一。因此，調(diào)控VEGF是治療銀屑病的關(guān)鍵方法之一[7]。然而，由于復(fù)雜的病因及化療的不良反應(yīng)，目前沒有較理想的銀屑病藥物用于臨床。芍藥苷(PF)是芍藥總葡萄糖苷(TGP)的主要成分，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)及護(hù)肝的功能。多項(xiàng)研究[8,9]指出，PF在銀屑病治療中具有抗炎作用，但其對(duì)銀屑病發(fā)病過(guò)程中血管生成增加是否有作用尚不清楚。2016年5月～2017年5月，我們觀察了PF對(duì)銀屑病小鼠的治療作用，并探討其是否通過(guò)調(diào)控銀屑病皮膚病變中的VEGF發(fā)揮作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 40只雌性8～11周齡小鼠，購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心小鼠，飼養(yǎng)于無(wú)病原微生物的環(huán)境，均按照動(dòng)物保護(hù)及應(yīng)用協(xié)會(huì)的指導(dǎo)說(shuō)明進(jìn)行。咪喹莫特(IMQ)霜(四川明欣藥業(yè))，純度96%的PF(寧波立華植物提取技術(shù)有限公司)。制冰機(jī)(北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器公司)，電熱恒溫水箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司)；正置顯微鏡(Olympus公司)，石蠟切片機(jī)(Leica公司)；Quanti Fast SYBR Green PCR Kit試劑盒(Qiagen公司)，Light CyclerTM480 Ⅱ型熒光定量PCR儀(Roche公司)，低溫冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，旋渦振蕩器(青浦瀘西儀器廠)，電動(dòng)勻漿機(jī)(Fluko公司)，mini protean 3 cell電泳儀(Bio-Rad 公司)，PS-9電轉(zhuǎn)儀(大連競(jìng)邁科技有限公司)；ELISA試劑盒(eBioscience公司)，MK3酶標(biāo)儀(Finnpipette公司)，Tanon-5200成像系統(tǒng)(Tanon公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組、造模與用藥處理 將40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。各組將小鼠背部毛發(fā)全部剔光，用Na2S擦拭。A組小鼠背部每天涂抹凡士林，連續(xù)涂抹7 d；B、C、D組小鼠均先用IMQ霜擦拭7 d(銀屑病造模)，B、C組分別腹腔注射生理鹽水、PF 200 mg/(kg·d)10 d，D組腹腔注射PF 200 mg/(kg·d)后6 h背部皮下注射重組VEGF蛋白 100 ng 10 d。 以小鼠背部出現(xiàn)一定范圍肉眼可見鱗屑性紅斑區(qū)域，判為銀屑病造模成功。在治療第18天小鼠被安樂死，收集皮損組織及眼眶靜脈血液標(biāo)本。

1.2.2 皮損組織病理觀察 收集皮損組織，以4%多聚甲醛固定后進(jìn)行石蠟包埋。從石蠟組織塊上切取4 μm厚切片，HE染色后光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)分析，并行微血管計(jì)數(shù)。采用Weidner微血管計(jì)數(shù)法評(píng)價(jià)：將切片置于40倍顯微鏡下確定染色最高血管密度區(qū)域，然后置于200倍顯微鏡下，選擇3個(gè)最高血管密度區(qū)進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，求其平均值。

1.2.3 外周血VEGF蛋白檢測(cè) 采用ELISA法，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.4 皮損組織VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR法。利用TRIzol試劑抽提小鼠背部皮膚組織總RNA，以M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶體系將總RNA(1 μg)反轉(zhuǎn)成cDNA。用于GADPH、VEGF、VEGFR1、VEGFR2基因檢測(cè)的RT-PCR引物序列，見表1。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA模板2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。以GAPDH基因作內(nèi)參，應(yīng)用 2-ΔΔCT方法分析相關(guān)基因VEGF、VEGFR1、VEGFR2的相對(duì)表達(dá)量。

表1 VEGF、VEGFR1、VEGFR2及內(nèi)參基因PCR引物序列 (5′→3′)

2 結(jié)果

2.1 各組皮損組織病理觀察結(jié)果 B、D組皮損組織具有典型的銀屑病樣病理特征，如表皮角化過(guò)度和角化不全，棘層增厚，表皮突下延，真皮乳頭內(nèi)血管增多、擴(kuò)張；相比之下，A組皮損組織未見病理學(xué)異常，C組皮損組織銀屑病樣病理特征顯著減輕。A、B、C、D組皮損組織中血管數(shù)分別為(9.33±3.51)、(21.33±3.51)、(11.33±3.05)、(14.67±4.16)條，B組皮損組織中血管數(shù)多于A、C、D組(P均<0.05)，D組多于C組但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 各組外周血VEGF蛋白水平比較 A、B、C、D組外周血VEGF蛋白水平分別為(92.47±18.87)、(232.70±48.38)、(114.52±27.72)、(162.96±30.22)pg/mL，B組外周血VEGF蛋白水平高于A、C、D組(P均<0.05)，D組高于C組但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 各組皮損組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達(dá)量比較 見表2。

表2 各組皮損組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達(dá)量比較

注：與A組比較，aP<0.05；與B比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05。

3 討論

銀屑病是最常見的慢性炎癥性增生性皮膚病之一，易復(fù)發(fā)，病情頑固且可造成全身系統(tǒng)損害。其主要的組織病理學(xué)改變?yōu)樾律苄纬?，角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。其中，新生血管形成可能是銀屑病發(fā)病的關(guān)鍵因素之一。

銀屑病在中醫(yī)文獻(xiàn)中有“干癬”“松皮癬”“白疕”等名稱。中醫(yī)學(xué)一般認(rèn)為，銀屑病初起多由風(fēng)寒、風(fēng)熱之邪侵襲，營(yíng)衛(wèi)失和，氣血不暢，阻于肌表，日久化熱而生；有的因脾虛失其運(yùn)化，濕熱蘊(yùn)積，外不能宣泄，內(nèi)不能利導(dǎo)，郁阻于肌膚所致；或者風(fēng)寒、風(fēng)熱、濕熱之邪日久化熱化燥，氣血耗傷則生風(fēng)化燥，肌膚失養(yǎng)，郁阻肌表而成；也有因享賦不足，肝腎兩虧，沖任失調(diào)而發(fā)病。近年來(lái)我們通過(guò)大量臨床經(jīng)驗(yàn)的積累，認(rèn)為該病是身心疾病，越來(lái)越重視情志因素在誘發(fā)和加重銀屑病中的作用。將銀屑病從肝論治，在龍膽瀉肝湯的基礎(chǔ)上配伍平肝柔肝藥白芍，調(diào)氣機(jī)而暢情志，對(duì)銀屑病的恢復(fù)有較好的效果。

白芍味苦、酸，入肝經(jīng)，能補(bǔ)肝血而柔肝。各路醫(yī)家用以疏肝理氣，柔肝養(yǎng)血，緩中止痛，平肝斂陰。其主要藥效成分被稱為白芍總苷，包括PF、羥基芍藥苷、芍藥花苷、苯甲酰和芍藥內(nèi)酯苷，其中PF占90%以上。PF是一種單萜類糖苷化合物，具有抗炎、抗過(guò)敏以及免疫調(diào)節(jié)的功效。我們前期研究采用獨(dú)特的治療干預(yù)模式，造模后實(shí)驗(yàn)組小鼠病變皮膚組織出現(xiàn)典型的銀屑病皮損特征，如表皮角化過(guò)度，角化不全，棘層肥厚，真皮和表皮炎癥浸潤(rùn)，真皮乳頭內(nèi)毛細(xì)血管增生、迂曲、擴(kuò)張等，這些指征在PF治療后得到了明顯的緩解；相反，同時(shí)予PF和VEGF處理的小鼠銀屑病皮損重回造模小鼠水平。表明PF全身給藥可有效緩解銀屑病造成的皮膚炎癥，而PF、VEGF聯(lián)合給藥可消除這種作用[10]。

VEGF又稱血管通透因子或血管調(diào)理素，最先從腫瘤細(xì)胞分離出來(lái)，是一種能與肝素結(jié)合的二聚體糖蛋白分子，并能特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是目前所發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)最強(qiáng)、最特異的血管活性因子，能促進(jìn)血管形成、增加血管通透性。VEGF在銀屑病皮損和血清中過(guò)表達(dá)，與銀屑病斑塊形成、真皮乳頭層毛細(xì)血管擴(kuò)張、扭曲密切相關(guān)。因此，VEGF在銀屑病發(fā)病機(jī)制中可能起關(guān)鍵作用。VEGF家族有5個(gè)成員，分別為VEGF-A、B、C、D、E和胎盤生長(zhǎng)因子。人體中最常見的是VEGF-A，其位于染色體6p21.3，全長(zhǎng)14 kb，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，是一種35～45 kb的同型二聚體糖蛋白，由兩個(gè)亞基通過(guò)二硫鍵相連。其氨基酸序列高度保守，與血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)及胎盤生長(zhǎng)因子之間具有部分同源性。

VEGF有VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3 3種受體,他們都是酪氨酸激酶受體(RTKs)，具有高親和力[11]。VEGF在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的潛在作用與VEGF基因多態(tài)性和銀屑病患者VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3過(guò)表達(dá)密切相關(guān)[12]。VEGFR1在正常血管發(fā)育中起重要作用，負(fù)責(zé)招募造血前體和引導(dǎo)單核細(xì)胞遷移；而VEGFR2則決定血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，其最重要的功能是增加血管通透性[13]。本研究結(jié)果顯示，VEGF、VEGFR1和VEGFR2基因水平在銀屑病小鼠的血清和皮損組織中均高表達(dá)，并且這種高表達(dá)水平在PF治療后恢復(fù)正常。PF、VEGF聯(lián)合給藥逆轉(zhuǎn)了PF對(duì)銀屑病小鼠的治療作用，這很好地解釋了VEGF在維持表皮屏障功能中的作用，表明角質(zhì)細(xì)胞增生與表皮VEGF之間存在重要聯(lián)系[14]。一些研究報(bào)道指出，實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)皮膚炎癥小鼠的表皮中VEGF過(guò)表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致出現(xiàn)了銀屑病的形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和免疫學(xué)特征[15]。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，銀屑病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵早期特征之一可能是通過(guò)上調(diào)VEGF及其受體引起表皮和免疫學(xué)改變。本研究中，D組皮損組織VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達(dá)量高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；雖然D組外周血VEGF蛋白水平高于C組，皮損組織中血管數(shù)多于C組，但尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這可能與本研究觀察時(shí)間較短，PF與VEGF聯(lián)合給藥已經(jīng)從基因水平進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)，但外周血及組織學(xué)方面尚未產(chǎn)生明顯變化有關(guān)。

綜上所述，PF對(duì)銀屑病小鼠的皮損具有一定治療作用，與其抑制VEGF及其受體表達(dá)抗血管生成有關(guān)。本研究闡明了PF治療銀屑病可能的分子機(jī)制，為銀屑病的治療提供了新思路。

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[1] Desmet E, Ramadhas A, Lambert J, et al. In vitro psoriasis models with focus on reconstructed skin models as promising tools in psoriasis research[J]. Exp Biol Med (May wood), 2017,242(11):1158-1169.

[2] Hegyi Z, Zwicker S, Bureik D, et al. Vitamin D analog calcipotriol suppresses the Th17 cytokine-induced proinflammatory S100 "alarmins" psoriasin (S100A7) and koebnerisin (S100A15) in psoriasis[J]. J Invest Dermatol, 2012,132(5):1416-1424.

[3] Ma HL, Liang S, Li J, et al. IL-22 is required for Th17 cell-mediated pathology in a mouse model of psoriasis-like skin inflammation[J]. J Clin Invest, 2008,118(2):597-607.

[4] Marina ME, Roman II, Constantin AM, et al. VEGF involvement in psoriasis[J]. Clujul Med, 2015,88(3):247-252.

[5] Nielsen HJ, Christensen IJ, Svendsen MN, et al. Elevated plasma levels of vascular endothelial growth factor and plasminogen activator inhibitor-1 decrease during improvement of psoriasis[J]. Inflamm Res, 2002,51(11):563-567.

[6] Nofal A, Al-Makhzangy I, Attwa E, et al. Vascular endothelial growth factor in psoriasis: an indicator of disease severity and control[J]. J Eur Acad Dermatol Venereol, 2009,23(7):803-806.

[7] Chen HQ, Li X, Tang R. Effects of narrow band ultraviolet B on serum levels of vascular endothelial growth factor and interleukin-8 in patients with psoriasis[J]. Am J Ther, 2016,23(3):655-662.

[8] Wen J, Wang X, Pei H, et al. Anti-psoriatic effects of Honokiol through the inhibition of NF-kappaB and VEGFR-2 in animal model of K14-VEGF transgenic mouse[J]. J Pharmacol Sci, 2015,128(3):116-124.

[9] Sun Y, Zhang J, Huo R, et al. Paeoniflorin inhibits skin lesions in imiquimod-induced psoriasis-like mice by downregulating inflammation[J]. Int Immunopharmacol, 2015,24(2): 392-399.

[10] Zhao J, Di T, Wang Y, et al. Paeoniflorin inhibits imiquimod-induced psoriasis in mice by regulating Th17 cell response and cytokine secretion[J]. Eur J Pharmacol, 2016,772:131-143.

[11] Son ED, Kim HJ, Kim KH, et al. S100A7 (psoriasin) inhibits human epidermal differentiation by enhanced IL-6 secretion through IkappaB/NF-kappaB signalling[J]. Exp Dermatol, 2016,25(8):636-641.

[12] Heidenreich R, Rocken M, Ghoreschi K. Angiogenesis drives psoriasis pathogenesis[J]. Int J Exp Pathol, 2009,90(3):232-248.

[13] Grun D, Adhikary G, Eckert RL. VEGF-A acts via neuropilin-1 to enhance epidermal cancer stem cell survival and formation of aggressive and highly vascularized tumors[J]. Oncogene, 2016,35(33):4379-4387.

[14] Shibuya M. Vascular endothelial growth factor and its receptor system: physiological functions in angiogenesis and pathological roles in various diseases[J]. J Biochem, 2013,153(1):13-19.

[15] Elias PM, Arbiser J, Brown BE, et al. Epidermal vascular endothelial growth factor production is required for permeability barrier homeostasis, dermal angiogenesis, and the development of epidermal hyperplasia: implications for the pathogenesis of psoriasis[J]. Am J Pathol, 2008,173(3):689-699.