高海霞,相珊,吳海萃,張楠,石壘,郭穎

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南250011；2山東中醫(yī)藥大學(xué))

枸杞子具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目之功效，臨床治療不孕不育的方劑中常含有枸杞子?，F(xiàn)代藥物分析表明，枸杞子營(yíng)養(yǎng)成分豐富，具有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等藥理作用[1]；而枸杞子中的總黃酮類成分具有降低血膽固醇，減少心臟搏動(dòng)，增加心臟收縮等作用[2]。目前枸杞子提取技術(shù)一般為水提法和醇提法，水提法提取的主要成分為枸杞子多糖，而醇提法提取的主要成分為黃酮類化合物。為研究枸杞子在治療不孕不育中的作用，揭示其在早期胚胎發(fā)育中的作用機(jī)制。2015年5月～2016年12月，我們分別采用水提法和醇提法從寧夏枸杞子獲得提取液，采用體外培養(yǎng)的方法，觀察其對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：健康、性成熟的昆明白小鼠150只，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。雌性120只，鼠齡7～8周，體質(zhì)量25～30 g；雄性30只，鼠齡8～10周，體質(zhì)量30～35 g。試劑：人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG)與人絨毛膜促性腺激素(HCG)，每支1 000 IU，均購(gòu)自寧波第二激素廠；配子準(zhǔn)備液(mHTF)、卵裂液(CSC)、培養(yǎng)基添加液(SSS)均購(gòu)自美國(guó)Irvine Scientific公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；Light Cycler 480 SYBR Green Ⅰ Master購(gòu)自美國(guó)Roche公司。枸杞子為寧夏紅，取自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。

1.2 枸杞子提取液制備 ①水提法：枸杞子100 g，清水清洗干凈，烘干，用1 000 mL超純水浸泡40 min；100 ℃煮沸蒸汽回流2 h，再加入1 000 mL超純水，100 ℃蒸汽回流1.5 h；80目濾網(wǎng)過濾，濃縮回流液體至<100 mL，容量瓶定容至100 mL；103.4 kPa、121.3 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，獲得枸杞子水提取液。②醇提法：枸杞子100 g，清水清洗干凈，烘干；1 000 mL無(wú)水乙醇浸泡40 min，煮沸蒸汽回流抽提2 h；沉渣中再加1 000 mL無(wú)水乙醇，再次抽提1.5 h；80目濾網(wǎng)過濾，濃縮液體至<100 mL，容量瓶定容至100 mL；103.4 kPa、121.3 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，獲得枸杞子醇提取液。

1.3 小鼠2細(xì)胞胚胎采集 將小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，雌性小鼠做超促排處理。下午4點(diǎn)，腹腔注射HMG(10 IU/只)，48 h后注射HCG(10 IU/只)，同時(shí)雌雄小鼠1∶1合籠。合籠次日晨7點(diǎn)檢查陰栓，有陰栓的雌雄小鼠分開，未見陰栓的繼續(xù)合籠；次日早上觀察1次，如仍無(wú)陰栓，將雌雄小鼠分開，14 d后未妊娠重新促排卵。合籠后42 h，頸椎脫臼法處死雌鼠，取雙側(cè)輸卵管，放入含mHTF的3037皿中；在解剖顯微鏡下找到輸卵管膨大壺腹部，用1 mL TB空針將該段輸卵管撕破，可見大量2細(xì)胞胚胎流出。收集2細(xì)胞胚胎，置于平衡的CSC培養(yǎng)液微滴中(15枚/滴)過夜，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 小鼠2細(xì)胞胚胎分組處理與發(fā)育情況觀察 將獲取的1 182個(gè)2細(xì)胞胚胎隨機(jī)分組，對(duì)照組168個(gè)以常規(guī)的CSC+SSS培養(yǎng)液培養(yǎng)；水提組和醇提組各507個(gè)，分別在常規(guī)培養(yǎng)液中加終濃度2.5、5.0、10.0 μg/mL的枸杞子水提取液或醇提取液培養(yǎng)；各組均將2細(xì)胞胚胎培養(yǎng)至囊胚，觀察并計(jì)算8細(xì)胞卵裂率和囊胚形成率。

1.5 小鼠囊胚轉(zhuǎn)錄因子檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR法。收集各組囊胚，用TaKaRa RNAiso Reagent試劑盒提取胚胎總RNA，按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明去除基因組DNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，對(duì)內(nèi)參基因GAPD和4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Nanog、Cdx2、Klf4進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)驗(yàn)，4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Nanog、Cdx2、Klf4和內(nèi)參基因GAPD引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：SYBRⅡGreen Buffer 10 μL，上下游引物各0.8 μL，Rox 0.4 μL，RNase Free H2O 6.0 μL，cDNA 2.0 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。每次實(shí)驗(yàn)3 次重復(fù)各得3個(gè)Ct值，用ΔΔCt法求目標(biāo)基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

表1 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和內(nèi)參基因PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

2 結(jié)果

2.1 枸杞子水(醇)提取液對(duì)小鼠2細(xì)胞胚胎發(fā)育的影響 見表2。

表2 枸杞子水(醇)提取液對(duì)小鼠2細(xì)胞胚胎發(fā)育的影響(%)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.2 枸杞子水(醇)提取液對(duì)小鼠囊胚轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響 見表3。

表3 枸杞子水(醇)提取液對(duì)小鼠囊胚轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組比較，#P<0.01。

3 討論

目前，臨床醫(yī)學(xué)主要從提高精子和卵子質(zhì)量、控制促排卵數(shù)量以及提高患者身體素質(zhì)等方面來(lái)提高胚胎質(zhì)量。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎主生殖，腎虛是導(dǎo)致生殖功能障礙的最主要病機(jī)。中醫(yī)以補(bǔ)腎養(yǎng)血活血等療法，對(duì)患者進(jìn)行全面調(diào)理。研究發(fā)現(xiàn)，中藥在促排卵、改善子宮內(nèi)膜容受性、減少并發(fā)癥等方面都產(chǎn)生積極的影響，通過中醫(yī)方劑調(diào)理來(lái)提高優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)量的報(bào)道不少。但是，中藥與胚胎質(zhì)量的直接關(guān)系尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，對(duì)中藥在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用的機(jī)制更未涉及。

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞子屬的干燥成熟果實(shí),在治療不孕不育的中藥方劑中多有應(yīng)用。枸杞子水提法提取的主要成分是枸杞子多糖，醇提法提取的主要成分為黃酮類化合物。本研究顯示，水提組小鼠2細(xì)胞胚胎的8細(xì)胞卵裂率和囊胚形成率均比對(duì)照組有所提高，且隨著提取物濃度增加而增加，表明枸杞子水提取液可能對(duì)小鼠胚胎發(fā)育有促進(jìn)作用。與8細(xì)胞卵裂率相比，10.0 μg/mL的水提取液方可顯著提高囊胚形成率，表明枸杞子水提取液對(duì)小鼠胚胎發(fā)育的影響可能在較早期即卵裂期起作用。醇提組8細(xì)胞卵裂率和囊胚形成率均比對(duì)照組有所提高，5.0、10.0 μg/mL的醇提取液可提高8細(xì)胞卵裂率和囊胚形成率，提示枸杞子醇提取液可能對(duì)小鼠胚胎早期發(fā)育有促進(jìn)作用。這些表明，枸杞子多糖和枸杞子黃酮類化合物均能促進(jìn)小鼠早期胚胎發(fā)育，提高8細(xì)胞卵裂率和囊胚形成率。

除胚胎系統(tǒng)學(xué)評(píng)價(jià)之外，胚胎發(fā)育中重要基因的表達(dá)變化能更準(zhǔn)確地反映胚胎質(zhì)量，甚至能反映單個(gè)胚胎間的細(xì)微差異[4]。Oct4是嚙齒類動(dòng)物早期胚胎發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，對(duì)植入前胚胎發(fā)育至關(guān)重要。Oct4基因敲減的胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)分化為滋養(yǎng)外胚層(TE)細(xì)胞，胚胎缺乏Oct4基因的表達(dá)不能形成正常的囊胚。本研究醇提組囊胚Oct4基因表達(dá)量較對(duì)照組升高，Niwa等[5]研究表明Oct4的作用效果依賴于其細(xì)胞核內(nèi)濃度，推測(cè)枸杞子黃酮類化合物處理能改善囊胚質(zhì)量。Nanog基因是2003年由Mitsui等[6]報(bào)道的，是在囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、原始生殖細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。缺乏Nanog的ES細(xì)胞喪失多能性，分化為胚外內(nèi)胚層細(xì)胞系。因此，Nanog對(duì)維持胚胎干細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的多能性起關(guān)鍵性作用[7，8]。本研究醇提組囊胚期Nanog基因表達(dá)量較對(duì)照組高，推測(cè)枸杞子黃酮類化合物處理有助于改善囊胚質(zhì)量。

Cdx2是一種特異性核轉(zhuǎn)錄因子，在囊胚的TE細(xì)胞和植入后期飼養(yǎng)層細(xì)胞中特異性表達(dá)[9，10]。雜合子Cdx2突變體顯示同源異型轉(zhuǎn)化缺陷[11]，而純合的Cdx2突變體在植入前死亡。這表明Cdx2對(duì)早期胚胎發(fā)育具有重要作用，提示它可能與胚胎的正常著床相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，枸杞子水提取液處理增加Cdx2基因表達(dá)，推測(cè)枸杞子多糖可能促進(jìn)TE細(xì)胞的生長(zhǎng)，利于胚胎的著床后發(fā)育。Klf4是機(jī)體內(nèi)一種具有重要功能的蛋白質(zhì)，調(diào)控多種組織細(xì)胞的增殖、凋亡和分化，參與胚胎發(fā)育過程，并與腫瘤發(fā)生有關(guān)。Yoon等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Klf4在維持G2/M細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)的完整性中發(fā)揮著重要作用；他們還發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞DNA受到損傷后，Klf4阻止中心體的復(fù)制、阻止細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂。近年來(lái)，Klf4在胚胎發(fā)育及胚胎干細(xì)胞多能性維持的調(diào)控作用逐漸引起廣泛關(guān)注。本研究顯示，枸杞子醇提取液能提高囊胚Klf4表達(dá)，推測(cè)枸杞子黃酮類化合物利于囊胚質(zhì)量的提高。

綜上所述，枸杞子黃酮類化合物可能主要通過促進(jìn)囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的發(fā)育及細(xì)胞全能性來(lái)促進(jìn)小鼠胚胎早期發(fā)育，對(duì)TE細(xì)胞的發(fā)育也有一定的促進(jìn)作用，因此枸杞子黃酮類化合物可能會(huì)提高小鼠胚胎的發(fā)育潛能及著床率；而枸杞子多糖可能促進(jìn)小鼠胚胎的早期發(fā)育，有利于小鼠胚胎植入后的發(fā)育。但是，本研究由于受胚胎數(shù)量的限制，未能同時(shí)從蛋白水平進(jìn)行探索，需要今后進(jìn)一步完善。

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