顧宇峰，譚曉慧，朱雪娟，湯偉，張彬，汪曉鶯，朱軼晴

(1南通大學附屬醫(yī)院，江蘇南通226001；2南通大學醫(yī)學院)

慢加急性肝衰竭(ACLF)是指在慢性肝病基礎上，短期內發(fā)生急性或亞急性肝功能失代償?shù)呐R床癥候群[1,2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在ACLF的免疫病理機制中，腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素17(IL-17)等炎性因子可能發(fā)揮了較為重要的作用。一項1 977例肝衰竭研究證明，ACLF仍是我國肝衰竭中最常見的類型，其中HBV相關ACLF約占90.29%[3]。目前，ACLF仍以內科綜合治療為主，必要時輔以人工肝支持或行肝移植術。自2006年版《肝衰竭診療指南》提出：對HBV-DNA陽性的肝衰竭患者,在知情同意的基礎上可盡早酌情使用核苷類似物如拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋等[4]。近年來，核苷類似物拉米夫定、恩替卡韋被廣泛用于HBV相關ACLF的治療，并取得較好的效果[5～10]。然而，在臨床上，我們時有遇到一些HBV相關ACLF患者，在加用恩替卡韋或拉米夫定治療后，病情不僅未能得到良好控制反而進一步加重的情況，其原因尚未明確。2013年3月～2014年3月，我們構建大鼠ACLF模型，觀察核苷類似物恩替卡韋和拉米夫定對ACLF的影響，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠40只,雄性，體質量180～200 g，由南通大學實驗動物中心提供。生產(chǎn)許可證號：SC×K(蘇)2008-0010；使用許可證號：SC×K(蘇)2007-0021。

1.1.2 藥物與試劑 拉米夫定(葛蘭素史克制藥有限公司，批號12090858)，每日臨用前以滅菌生理鹽水配制成濃度為21 mg/mL的溶液。恩替卡韋(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號1210668)，每日臨用前以滅菌生理鹽水配制成濃度為0.105 mg/mL的溶液。四氯化碳(CCl4，上海潤捷化學試劑有限公司，批號20110601)，將其與橄欖油(上海嘉里食品有限公司)按體積比混合配制成40% CCl4溶液。細菌脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司，批號L4516；D-氨基半乳糖(D-Gal)購自美國Sigma公司，批號G0500；豬血清購自廣州蕊特生物科技有限公司，批號111220。IL-17、TNF-α ELISA試劑盒均購自美國eBiosience公司，批號分別為69595004、69816030；HE染色試劑盒購自德國默克公司，批號G1120。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 將40只SD大鼠先隨機分為兩組，其中對照組8只、實驗組32只。待實驗組慢性肝損傷模型建成后，將其再隨機分為模型組8只、拉米夫定組12只、恩替卡韋組12只。

1.2.2 大鼠ACLF模型制備 參照譚曉慧等[11]的方法，除對照組外，實驗組均腹腔注射40% CCl41 mL/kg(2次/周)及豬血清0.5 mL(1次/周)，持續(xù)4周，以誘導慢性肝損傷；對照組腹腔注射相同體積生理鹽水。慢性肝損傷模型建成后，實驗組大鼠均給予D-Gal 0.3 g/kg及LPS 30 μg/kg腹腔內注射1次，以誘導ACLF；對照組腹腔注射相同體積的生理鹽水。

1.2.3 藥物干預 于聯(lián)合注射D-Gal及LPS 6 h后，拉米夫定組及恩替卡韋組大鼠分別給予拉米夫定10 mg/kg(相當于成人60 kg體質量服用100 mg)或恩替卡韋 0.05 mg/kg(相當于成人60 kg體質量服用0.5 mg)灌胃，1次/d，連續(xù)3 d；對照組及模型組大鼠給予相同體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)3 d。

1.2.4 肝功能和血清TNF-α、IL-17檢測 分別于慢性肝損傷造模4周和誘導ACLF后24、72 h各采血1次，采血前24 h禁食不禁水。大鼠眼球后眥靜脈叢取血，靜置30 min后以3 000 r/min離心20 min,分離血清，立刻檢測肝功能指標(ALT、AST、TBIL)。末次血清分為2份，分別檢測肝功能指標和TNF-α、IL-17。血清TNF-α、IL-17檢測采用雙抗體夾心ELISA法，按試劑盒說明操作。以標準品測試后求得回歸方程分別為y(TNF-α)=647.11x2+1 487.61x-71.838、y(IL-17)=-65.862x2+179.85x-5.984 6，將各血清標本的OD值代入此回歸方程計算出其相應濃度。

1.2.5 肝組織病理檢查 于腹腔注射D-Gal+LPS 72 h(末次取血)后，處死各組動物。取相同部位肝臟組織約1 cm×1 cm，置于10%甲醛溶液中固定24 h；常規(guī)石蠟包埋，以切片機切成4 μm切片。采用HE染色和Masson染色，光學顯微鏡下觀察并拍攝照片。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況 對照組大鼠活動正常，反應靈敏，毛發(fā)有光澤，飲食、大小便均正常，體質量持續(xù)增加，無死亡現(xiàn)象。實驗組大鼠隨著CCl4及豬血清給藥時間的延長，活動逐漸減少,精神萎靡，毛發(fā)疏松無光澤，進食量減少,常排不成形大便,體質量增長緩慢。在給予D-Gal、LPS急性攻擊后24～48 h內，拉米夫定組死亡2只，模型組及恩替卡韋組無動物死亡。

2.2 各組大鼠慢性肝損傷時的肝功能指標比較 CCl4及豬血清注射4周后，實驗組及其他各干預組血清AST、ALT、TBIL均高于對照組(P均<0.05)，而模型組、拉米夫定組、恩替卡韋組3組間血清AST、ALT、TBIL水平差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 慢性肝損傷造模4周時各組大鼠肝功能指標比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 各組大鼠誘導ACLF后24、72 h肝功能指標比較 在誘導ACLF后24 h，拉米夫定組中8只(67%)、恩替卡韋組中7只(58%)大鼠血清AST、ALT、TBIL均超過模型組均值。拉米夫定組和恩替卡韋組血清AST、ALT、TBIL均高于模型組(P均<0.05)，拉米夫定組血清AST、ALT、TBIL均高于恩替卡韋組，但差異無統(tǒng)計學意義。在誘導ACLF后72 h，模型組、拉米夫定組、恩替卡韋組血清AST、ALT、TBIL較24 h時均下降(P均<0.01)；但拉米夫定組血清ALT、TBIL均仍高于模型組(P均<0.05)，拉米夫定組血清AST雖高于模型組但差異無統(tǒng)計學意義；恩替卡韋組血清AST、ALT、TBIL雖均高于模型組但差異均無統(tǒng)計學意義，其血清AST、ALT、TBIL雖均低于拉米夫定組但差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 誘導ACLF后24、72 h各組大鼠肝功能指標比較

注：與對照組同時點比較，*P<0.05，#P<0.01；與模型組同時點比較，△P<0.05，▲P<0.01；與同組誘導ACLF后24 h比較，○P<0.01。

2.4 各組大鼠誘導ACLF后72 h血清TNF-α和IL-17水平比較 誘導ACLF后72 h，模型組、拉米夫定組、恩替卡韋組大鼠血清TNF-α、IL-17均高于對照組，但此兩種因子水平在四組大鼠間的差異均無統(tǒng)計學意義(FTNF-α=1.131，P=0.357；FIL-17=0.608，P=0.617)。見表3。

表3 誘導ACLF后72 h各組大鼠血清TNF-α和IL-17水平比較

2.5 各組大鼠肝臟病理檢查情況 ①HE染色：正常組可見肝小葉結構完整，肝細胞形態(tài)正常、排列有序，呈條索狀圍繞中央靜脈，匯管區(qū)無炎細胞浸潤，膽小管細胞無腫脹。模型組可見肝小葉結構破壞，假小葉形成，肝細胞排列紊亂，空泡化，肝細胞局灶性壞死，肝竇擴張，匯管區(qū)有炎細胞浸潤。 拉米夫定組、恩替卡韋組所見與模型組大致相仿，但肝細胞局灶性壞死較模型組多見，且可看到片狀壞死；拉米夫定組較恩替卡韋組重。②Masson染色：正常組血管周圍偶見少量細短藍色纖維。模型組、拉米夫定組和恩替卡韋組肝臟組織中纖維明顯增多，可見相互連接形成的纖維間隔。

3 討論

HBV相關ACLF是慢性乙型肝炎或乙肝肝硬化患者因某種原因誘發(fā)嚴重急性肝損傷而導致的急性或亞急性肝衰竭，其病情演變過程如其他原因所致的肝衰竭一樣可分為重癥傾向期、上升期、平臺期和恢復期[12,13]。HBV相關ACLF的發(fā)病機制不僅與體內的HBV復制狀況有關，更與機體免疫系統(tǒng)對HBV的清除有關。體內的HBV載量升高或基因變異可誘發(fā)機體強烈的免疫清除，使大量HBV感染的肝細胞損傷，這往往只是ACLF的始動因素[14,15]；而HBV免疫清除過程中產(chǎn)生的炎癥反應，則可能是引起肝組織進一步大量損傷，乃至肝衰竭發(fā)生的關鍵原因。

在本研究中，我們以CCl4聯(lián)合豬血清誘導大鼠產(chǎn)生慢性肝損傷，再給予D-Gal、LPS聯(lián)合攻擊以誘導ACLF，并對拉米夫定組和恩替卡韋組大鼠在聯(lián)合攻擊后分別按成人劑量給予拉米夫定或恩替卡韋灌胃。在實驗過程中，我們觀察到給予D-Gal、LPS聯(lián)合攻擊24 h后，各處理組大鼠肝功能指標均較攻擊前大幅度升高，且拉米夫定組和恩替卡韋組肝功能損傷較未服用核苷類似物的模型組更高，但恩替卡韋組肝功能指標低于拉米夫定組；聯(lián)合攻擊24～48 h，拉米夫定組中有2只死亡；聯(lián)合攻擊72 h后，模型組、拉米夫定組和恩替卡韋組肝功能指標均較攻擊24 h時下降，但拉米夫定組和恩替卡韋組仍明顯高于模型組。這一結果提示，在ACLF發(fā)生的急性發(fā)作期或肝功能指標上升期，給予核苷類似物拉米夫定或恩替卡韋服用，均有可能加重肝組織損傷，且以拉米夫定稍重；但當病程進入平臺期后，繼續(xù)服用此兩種核苷類似物則對肝組織損傷的修復無明顯影響。

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，多數(shù)發(fā)生肝臟重度炎癥或重型肝炎患者血清TNF-α水平增高[16,17]。實驗研究表明，TNF-α不僅能介導內毒素或LPS對肝細胞的損傷，而且對肝細胞具有直接的損傷作用。肝臟發(fā)生炎癥病變時，肝組織Kupffer細胞內核轉錄因子κB被激活，誘導包括TNF-α在內的多種炎癥因子表達，TNF-α可直接誘導肝實質細胞凋亡、壞死，其表達水平與炎癥病變程度呈正相關；而且，對實驗動物給予抗 TNF受體1中和抗體，可以明顯減輕肝損傷[18～20]。

IL-17是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種具有促炎癥作用的細胞因子，主要由Th17細胞產(chǎn)生，其受體(IL-17R)在體內廣泛表達尤其是在粒細胞、單核-吞噬細胞系統(tǒng)；當IL-17與IL-17R結合后可激活細胞，導致趨化因子、集落刺激因子和黏附分子的表達或釋放，招募和激活炎癥細胞尤其是嗜中性粒細胞，介導或加強炎癥反應，從而促進病原體的清除和自身免疫病理損害[21]。有實驗研究報告，予以IL-17中和抗體可以明顯降低自身免疫性肝炎模型小鼠血清ALT水平，且肝組織炎癥病變減輕[22]。在臨床上觀察到，慢性乙型肝炎發(fā)作時，血清IL-17水平與ALT、TBIL、凝血酶原時間呈正相關，HBV相關ACLF患者血清IL-17水平高于失代償性乙肝肝硬化患者；HBV相關ACLF患者Th17細胞及血清IL-17水平升高，且血清IL-17水平與終末肝病模型(MELD)評分呈正相關，預后不佳者血清IL-17水平高于預后好轉者[23～25]。這些研究結果提示，在ACLF的發(fā)病機制中，炎癥反應是導致肝組織嚴重損傷和肝功能衰竭的關鍵原因。

為了解核苷類似物加重肝損傷的機制，我們檢測了誘導ACLF后72 h各組動物的血清TNF-α及IL-17水平。結果顯示，拉米夫定組和恩替卡韋組血清TNF-α、IL-17水平高于模型組，但3組間差異并不具有統(tǒng)計學意義。對此結果，可作兩方面分析：其一，檢測標本留取時間太遲(給予D-Gal和LPS急性攻擊后72 h)，實驗動物的肝損傷已較急性攻擊后24 h明顯改善，但此時兩個核苷類似物治療組血清TNF-α、IL-17水平尤其是拉米夫定組TNF-α水平仍較高，提示核苷類似物可能加重了D-Gal和LPS急性攻擊后產(chǎn)生的炎癥反應。其二，與本實驗動物樣本數(shù)量較少有關。

張鶴等[26]對53例HBV相關ACLF患者血清HBV-DNA載量變化與疾病預后之間的關系進行了回顧分析，認為發(fā)病前及治療初期單一時間點HBV-DNA與預后關系不大；HBV-DNA升高或降低>2 log在存活組所占比率明顯低于死亡組，HBV-DNA維持不變或變化<2 log存活組則明顯高于死亡組，統(tǒng)計學分析表明上述改變模式在2組間的差異有統(tǒng)計學意義。此結果提示，在HBV相關ACLF發(fā)病初期，對HBV強烈的免疫清除很可能伴隨較為劇烈的肝臟炎癥損傷甚至預后不佳。結合本研究結果，我們認為對慢性乙型肝炎嚴重發(fā)作或HBV相關ACLF發(fā)病初期、病情迅速進展的患者，應首先給予抗炎保肝治療以期盡快抑制或減輕肝臟的炎癥病變，1周左右后再加用核苷類似物抑制HBV復制、減輕后繼對HBV免疫清除而引起的肝損傷，如此或許更有利于患者的康復。

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