宋丹，鄭勇斌，童仕倫，肖曠，楊超，楊玉杰，黃曉東

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060)

近年來(lái)，隨著內(nèi)窺鏡技術(shù)的發(fā)展，使得結(jié)直腸內(nèi)不典型增生病變實(shí)現(xiàn)了早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，且因創(chuàng)傷小、操作方便等優(yōu)勢(shì)而廣泛用于臨床[1～3]。同時(shí)，科研人員也試圖將內(nèi)窺鏡技術(shù)應(yīng)用到小鼠結(jié)直腸癌模型構(gòu)建中，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[4]，如Becker等[5]建立的應(yīng)用于活體小鼠的結(jié)腸鏡技術(shù)。但不同于人結(jié)腸鏡，小鼠結(jié)腸鏡成本較高，且小鼠結(jié)直腸癌模型構(gòu)建相對(duì)較困難，均限制了其推廣應(yīng)用[6]。因此，2015年1～12月，我們制備了攜帶Cre酶的慢病毒，經(jīng)改造后的硬質(zhì)內(nèi)窺鏡行APCloxP/loxP基因工程鼠結(jié)直腸黏膜下注射，構(gòu)建模擬人結(jié)直腸癌散發(fā)性癌灶模型，同時(shí)在慢病毒注射后應(yīng)用纖維支氣管鏡實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況，并與小鼠活體成像及解剖后檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，以探索其在小鼠結(jié)直腸癌模型構(gòu)建中的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡健康雄性SPF級(jí)C57小鼠雌雄各取15只、4周齡健康雄性APCloxP/loxP基因工程鼠100只，SPF環(huán)境12 h晝夜交替，適宜溫度、濕度下飼養(yǎng)，小鼠實(shí)驗(yàn)前不做禁食禁水處理。

1.1.2 設(shè)備與試劑 設(shè)備：CO2恒溫孵箱(Thermo Fisher公司)，倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)，超凈工作臺(tái)。試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基，PBS，胎牛血清(Gibco公司)，胰酶等；CaCl2轉(zhuǎn)染試劑盒(碧云天公司)，慢病毒濃縮純化試劑盒(Biomiga公司)。質(zhì)粒：慢病毒載體pHIV-Ubi-Cre-EGFP-SV40-Luc-IRES-Puromycin、包裝質(zhì)粒pMD2.G(addgene12259)與psPAX2(addgene12260)。

1.1.3 內(nèi)窺鏡 包括硬質(zhì)內(nèi)窺鏡與纖維支氣管鏡(PENTAX,FB-8V)。硬質(zhì)鏡上綁定2根導(dǎo)管(硬膜外導(dǎo)管替代)，1根導(dǎo)管連接氣體加壓設(shè)備，另1根導(dǎo)管用作微量注射針通道。配套設(shè)備包括圖像采集系統(tǒng)、氣體加壓設(shè)備及光源。

1.2 人結(jié)直腸癌散發(fā)性癌灶模型構(gòu)建

1.2.1 美藍(lán)小鼠結(jié)直腸黏膜下注射 4周齡健康雄性SPF級(jí)C57小鼠30只，用0.5%戊巴比妥鈉麻醉小鼠并將其固定于操作臺(tái)上；取出硬質(zhì)內(nèi)窺鏡并打開(kāi)成像系統(tǒng)、光源及氣體加壓設(shè)備，對(duì)固定好的小鼠行擴(kuò)肛操作。此步驟需細(xì)致溫柔，可涂抹甘油于擴(kuò)肛器上以減少損傷。肛門擴(kuò)張完畢，用適量生理鹽水清潔灌腸，以保證操作視野及操作空間；導(dǎo)入硬質(zhì)內(nèi)窺鏡，使用微量注射器吸取30 μL美藍(lán)溶液，以輕柔而快速的動(dòng)作將其注射至結(jié)直腸黏膜中(圖1、2)；避免反復(fù)操作，切勿刺破腸壁。注射完畢后，將小鼠放回鼠籠。觀察美藍(lán)滲漏情況，以評(píng)價(jià)該方法的可行性。

注：A:硬質(zhì)內(nèi)窺鏡；B:纖維支氣管鏡；C:病毒結(jié)直腸黏膜下注射操作；D:纖維支氣管鏡腸腔內(nèi)檢查操作。

圖1小鼠結(jié)腸鏡系統(tǒng)

圖2 小鼠結(jié)直腸黏膜下慢病毒注射示意圖及腸鏡檢查情況

1.2.2 慢病毒包裝與濃縮純化 轉(zhuǎn)染前30 min，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入新鮮不含抗生素的完全培養(yǎng)基。取4 μg待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，加入到100 μL CaCl2溶液中混勻(按6孔板的1個(gè)孔進(jìn)行說(shuō)明)。隨后將DNA-CaCl2溶液加入到100 μL PBS溶液中混勻，室溫孵育15 min后加入到培養(yǎng)板中，用細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞上清液并按照Biomiga慢病毒濃縮純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行病毒濃縮純化，收獲的病毒保存于-80 ℃冰箱待用。

1.2.3 慢病毒顆粒行小鼠灌腸 隨機(jī)選取轉(zhuǎn)基因鼠50只(灌腸組)，用0.5%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，并將其固定于操作臺(tái)上；按前述方案擴(kuò)肛后，用1 mL注射器吸取生理鹽水清潔灌腸3次；吸取30 μL病毒顆粒(病毒放置于冰上攜帶至動(dòng)物房)注入結(jié)腸腸腔內(nèi)，抽出注射器，按壓肛門并使小鼠取頭低腳高位保持30 min。

1.2.4 慢病毒顆粒經(jīng)硬質(zhì)內(nèi)窺鏡行小鼠結(jié)直腸黏膜下注射 取剩余的轉(zhuǎn)基因鼠50只(注射組)，麻醉及固定操作同灌腸組；取出硬質(zhì)內(nèi)窺鏡，打開(kāi)成像系統(tǒng)、光源及氣體加壓設(shè)備；對(duì)小鼠按前述方案擴(kuò)肛后，用微量注射器吸取30 μL病毒顆粒(病毒放置于冰上攜帶至動(dòng)物房)注射至小鼠結(jié)直腸黏膜下。

1.3 內(nèi)窺鏡監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)生 慢病毒感染后第3周開(kāi)始，每周利用纖維支氣管鏡監(jiān)測(cè)成瘤情況。檢查前用0.5%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，并將其固定于操作臺(tái)上；取出纖維支氣管鏡，打開(kāi)成像系統(tǒng)、光源及氣體加壓設(shè)備；按前述方法對(duì)小鼠擴(kuò)肛，石蠟油潤(rùn)滑鏡體后細(xì)致輕柔導(dǎo)入小鼠結(jié)直腸內(nèi)，觀察腸腔內(nèi)腫瘤發(fā)生情況。

1.4 小鼠活體成像監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)生 慢病毒感染后第3周開(kāi)始，每周行小鼠活體成像監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移情況。無(wú)菌PBS將D-熒光素鈉鹽配制成15 mg/mL，0.2 μm濾器過(guò)濾除菌后混勻，冰冷避光保存。按10 μL/g體質(zhì)量濃度腹腔注射相應(yīng)體積的15 mg/mL D-熒光素鈉鹽。注射入體內(nèi)10～20 min(待光信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)穩(wěn)定平臺(tái)期)后行成像分析。

1.5 解剖取材檢測(cè)腫瘤發(fā)生及其組織病理學(xué)評(píng)價(jià) 第9周末，所有小鼠行安樂(lè)死并解剖探查，記錄腫瘤發(fā)生發(fā)展情況。同時(shí)，將盲腸至直腸的消化道取出，仔細(xì)剝離腸系膜、脂肪等腸外組織。注射器抽取PBS沖洗凈腸道，用4%多聚甲醛沖洗腸道預(yù)固定10 min后，以PBS沖洗凈多聚甲醛；沿縱軸剪開(kāi)腸腔，將其鋪展開(kāi)后拍照，記錄腫瘤發(fā)生的數(shù)目、位置及大小。隨后行常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，常規(guī)HE染色，判斷腫瘤類型。

1.6 內(nèi)窺鏡的安全性評(píng)價(jià) 操作過(guò)程中，分別記錄硬質(zhì)內(nèi)窺鏡與纖維支氣管鏡所致結(jié)直腸穿孔引起小鼠死亡的情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件。兩個(gè)樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，Spearman等級(jí)相關(guān)分析纖維支氣管鏡檢出結(jié)果與解剖后取材檢出結(jié)果之間的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌模型鼠構(gòu)建情況 30只小鼠采用美藍(lán)行結(jié)直腸黏膜下注射實(shí)驗(yàn)，23只可見(jiàn)結(jié)腸黏膜下隆起，且退針后未見(jiàn)美藍(lán)滲漏，其注射成功率為76.7%。灌腸組灌腸后第3天不明原因死亡2只，剩余48只中7只解剖取材可見(jiàn)腫瘤發(fā)生，腫瘤發(fā)生率為14%。注射組中3只因結(jié)腸穿孔引發(fā)膿毒血癥死亡,剩余47只中21只解剖取材可見(jiàn)腫瘤發(fā)生，腫瘤發(fā)生率為42%。灌腸組成瘤率低于注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.38，P<0.05)。

2.2 結(jié)直腸癌模型鼠腫瘤檢出情況 100只小鼠中，解剖取材探查發(fā)現(xiàn)成瘤小鼠28只、瘤塊34個(gè)，纖維支氣管鏡檢出成瘤小鼠21只、瘤塊26個(gè)(76.5%)，其中腫塊直徑<2 mm以及距離肛門超過(guò)2 cm的腫塊檢出率較低(表1、2)。纖維支氣管鏡檢出腫瘤的位置(距肛外緣距離)、大小與解剖檢測(cè)結(jié)果相關(guān)(r分別為0.99、0.97，P均<0.05)。小鼠活體成像檢出28只陽(yáng)性，檢出率為100%。

表1 不同大小腫瘤纖維支氣管鏡檢出情況

表2 不同位置腫瘤纖維支氣管鏡檢出情況

2.3 內(nèi)窺鏡安全性情況 注射組經(jīng)硬質(zhì)內(nèi)窺鏡行結(jié)直腸黏膜下注射過(guò)程中，發(fā)生結(jié)腸穿孔3只，均因腹腔感染及全身膿毒血癥死亡。纖維支氣管鏡檢查過(guò)程中，兩組未發(fā)生結(jié)直腸穿孔。

2.4 組織病理學(xué)結(jié)果 所有腫塊進(jìn)行常規(guī)HE染色，發(fā)現(xiàn)腫塊均為腺瘤。

3 討論

目前，結(jié)腸鏡檢查不僅是結(jié)直腸疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)可根據(jù)病情及時(shí)行鏡下微創(chuàng)治療，因此廣泛用于臨床[7，8]。但是，小鼠結(jié)腸鏡在小鼠結(jié)直腸癌模型構(gòu)建中的應(yīng)用仍不理想，一方面由于模型構(gòu)建難度高，另一方面由于小鼠結(jié)腸鏡的技術(shù)要求高、成本及維修費(fèi)用高，限制了它的推廣與使用[9～12]。據(jù)此，本研究試圖結(jié)合使用硬質(zhì)內(nèi)窺鏡與纖維支氣管鏡，探索其在小鼠結(jié)直腸癌模型構(gòu)建中的應(yīng)用。

截至目前，為了構(gòu)建模擬人結(jié)直腸癌散發(fā)性癌灶，有研究通過(guò)將CDX2P 9.5-NLS Cre小鼠胚胎與APCloxP/loxP小鼠胚胎共移植到C57BL/6J假孕小鼠子宮中，實(shí)現(xiàn)結(jié)腸部位APC基因的突變，以構(gòu)建原發(fā)性結(jié)直腸癌[13]；或者使用表達(dá)Cre酶的慢病毒或腺病毒對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠灌腸，使其感染結(jié)直腸黏膜下干細(xì)胞并敲除APC基因，使干細(xì)胞突變誘發(fā)結(jié)直腸癌的發(fā)生[14，15]。然而，此類研究仍無(wú)法精確控制腫瘤的生長(zhǎng)位置與數(shù)量，模型鼠之間同質(zhì)性較低。若能將慢病毒顆粒局部注射到結(jié)直腸黏膜下，使其感染1個(gè)或多個(gè)結(jié)腸隱窩內(nèi)干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)特定部位基因的敲除，便可更高效構(gòu)建出模擬人的散發(fā)性癌灶。據(jù)此，我們?cè)谟操|(zhì)內(nèi)窺鏡基礎(chǔ)上進(jìn)行部分改造后以替代小鼠結(jié)腸鏡，建立了內(nèi)窺鏡下小鼠結(jié)直腸黏膜下慢病毒注射的方法。同時(shí)采用前期繁育的APCloxP/loxP小鼠，將攜帶Cre酶的慢病毒顆粒注射入該小鼠結(jié)直腸黏膜下，使其感染隱窩功能干細(xì)胞并修飾APC基因，從而誘發(fā)干細(xì)胞突變，構(gòu)建模擬人結(jié)直腸癌散發(fā)性癌灶。

實(shí)驗(yàn)前期，本研究應(yīng)用硬質(zhì)內(nèi)窺鏡行小鼠結(jié)直腸黏膜下美藍(lán)注射訓(xùn)練，其注射成功率均維持在70%以上；隨后，在進(jìn)行慢病毒黏膜下注射的實(shí)驗(yàn)中，其成瘤率為42%，相較于慢病毒灌腸組(成瘤率為14%)，其成功率明顯提高。由于慢病毒感染后第3周開(kāi)始即可檢測(cè)到被感染部位報(bào)告基因的表達(dá)，且腫瘤一般發(fā)生在第3～9周。因此，本研究于第3周開(kāi)始采用纖維支氣管鏡定期監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，并記錄腫塊大小與位置。第9周末將95只小鼠行安樂(lè)死并解剖取材，病理檢查表明28只小鼠共形成34個(gè)瘤塊，其中前期纖維支氣管鏡檢出26個(gè)瘤塊，檢出率76.5%，當(dāng)腫塊體積<2 mm或位置越過(guò)結(jié)腸脾曲時(shí)均較難檢出。另外，分析發(fā)現(xiàn)纖維支氣管鏡檢出腫瘤的位置、大小與解剖后檢查結(jié)果相關(guān)。盡管纖維支氣管鏡無(wú)法避免出現(xiàn)一定的漏檢情況，但仍能很好地實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，可用小鼠活體成像法彌補(bǔ)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的全程監(jiān)視，并可提示在合適時(shí)機(jī)進(jìn)行取材。

在內(nèi)窺鏡下注射慢病毒時(shí)，約4%小鼠出現(xiàn)結(jié)腸穿孔。為避免此種情況的發(fā)生，在注射過(guò)程中應(yīng)細(xì)致輕柔，避免反復(fù)注射，選擇微量注射器，注射針頭使用石蠟油潤(rùn)滑等。另外，維持穩(wěn)定的氣壓在注射過(guò)程中具有重要作用，一方面可以擴(kuò)大操作視野，另一方面可以展平腸內(nèi)壁，從而更有利于腸黏膜下注射。行慢病毒注射前，不必禁食禁水，以免造成小鼠內(nèi)環(huán)境紊亂，其結(jié)腸內(nèi)容物可通過(guò)按摩小鼠腹部使其排除或使用生理鹽水灌洗。因腸壁內(nèi)壓力較高，病毒注射時(shí)應(yīng)緩慢推注，以免病毒溶液溢出。注射后半小時(shí)內(nèi)應(yīng)使小鼠維持在麻醉狀態(tài)，避免因小鼠活動(dòng)造成注射部位病毒溶液溢出。 對(duì)于明顯成瘤者，在行內(nèi)窺鏡檢查的同時(shí)，利用活檢鉗取材并活檢，可及時(shí)監(jiān)測(cè)到腫塊發(fā)生的性質(zhì)。雖然，內(nèi)窺鏡的檢出率較低，但可反復(fù)在體取材進(jìn)行標(biāo)本研究。而活體成像不僅可監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)生，還可以監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，在轉(zhuǎn)移灶發(fā)生前，通過(guò)內(nèi)窺鏡檢查原發(fā)灶的局部特性，待小鼠活體成像確定轉(zhuǎn)移灶形成后，對(duì)小鼠行安樂(lè)死取材檢查轉(zhuǎn)移灶性質(zhì)，兩者結(jié)合可更好地研究結(jié)直腸癌的局部免疫狀態(tài)及其他特性。

綜上所述，本研究探索了內(nèi)窺鏡在造模以及腫瘤發(fā)生發(fā)展中的監(jiān)測(cè)作用，盡管無(wú)法保證每只小鼠100%的成功率，但因其突出的優(yōu)勢(shì)，仍具有廣闊的應(yīng)用前景。

：

[1] Kuipers EJ, Rosch T, Bretthauer M. Colorectal cancer screening--optimizing current strategies and new directions[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2013,10(3):130-142.

[2] 李?yuàn)檴?張慧超,徐丹,等.傳統(tǒng)結(jié)腸鏡檢查法的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2017,17(6):1180-1182.

[3] 殷漢華,司丕成,楊四清,等.結(jié)腸鏡在結(jié)直腸癌并急性腸梗阻診治中的應(yīng)用價(jià)值分析[J]. 河北醫(yī)學(xué),2015,21(8):1449-1451.

[4] van Rijn JC, Reitsma JB, Stoker J, et al. Polyp miss rate determined by tandem colonoscopy: a systematic review[J]. Am J Gastroenterol, 2006,101(2):343-350.

[5] Becker C, Fantini MC, Neurath MF. High resolution colonoscopy in live mice[J]. Nat Protoc, 2006,1(6):2900-2904.

[6] 舒冰焰.經(jīng)結(jié)腸鏡盲腸壁下注射小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株建立實(shí)體瘤模型[J].中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2013,20(7):819.

[7] 文韻玲.結(jié)腸鏡、超聲內(nèi)鏡及CTE在炎癥性腸病診斷中的價(jià)值研究[D].昆明：昆明醫(yī)科大學(xué),2017.

[8] Spinzi G, Minoli G. A comparison of colonoscopy and double-contrast barium enema for surveillance after polypectomy[J]. Gastrointest Endosc, 2001,54(3):417-418.

[9] Hensley HH, Merkel CE, Chang WC, et al. Endoscopic imaging and size estimation of colorectal adenomas in the multiple intestinal neoplasia mouse[J]. Gastrointest Endosc, 2009,69(3 Pt 2):742-749.

[10] Durkee BY, Shinki K, Newton MA, et al. Longitudinal assessment of colonic tumor fate in mice by computed tomography and optical colonoscopy[J]. Acad Radiol, 2009,16(12):1475-1482.

[11] van Rijn JC, Reitsma JB, Stoker J, et al. Polyp miss rate determined by tandem colonoscopy: a systematic review[J]. Am J Gastroenterol, 2006,101(2):343-350.

[12] Schwegmann K, Bettenworth D, Hermann S, et al. Detection of early murine colorectal cancer by MMP-2/-9-Guided fluorescence endoscopy[J]. Inflamm Bowel Dis, 2016,22(1):82-91.

[13] Adachi T, Hinoi T, Sasaki Y, et al. Colonoscopy as a tool for evaluating colorectal tumor development in a mouse model[J]. Int J Colorectal Dis, 2014,29(2):217-223.

[14] Vaish V, Kim J, Shim M. Lentivirus-mediated somatic recombination and development of a novel mouse model for sporadic colorectal cancer[J]. Genes Chromosomes Cancer, 2016,55(7):577-590.

[15] Hung KE, Maricevich MA, Richard LG, et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010,107(4):1565-1570.