張琪，楊光華，劉少鵬，丁家杉，韓學超，張國志，王長友

(1華北理工大學附屬醫(yī)院，河北唐山063000；2華北理工大學臨床醫(yī)學院；3華北理工大學醫(yī)學實驗中心)

結(jié)腸癌是以腺癌為主的常見消化道惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率逐年上升[1]，2015年在我國的腫瘤新發(fā)病例中排第5位[2]。惡性腫瘤的發(fā)生與細胞周期調(diào)控失常導致細胞異常增生有關(guān)，細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p21是重要的細胞周期調(diào)節(jié)蛋白。解整合素樣金屬蛋白酶17(ADAM17)又稱腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶(TACE)，主要參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、增殖、遷移、侵襲及遠處轉(zhuǎn)移[3, 4]。2017年1～6月，我們通過體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌細胞HT29，構(gòu)建ADAM17干擾逆轉(zhuǎn)錄病毒，觀察ADAM17低表達后對HT29結(jié)腸癌細胞增殖能力的影響，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌細胞株HT29購自中國科學院干細胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶(美國Gibco公司)。TRIzol、Go ScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、real-time PCR試劑盒(美國Invitrogen公司)；CCK-8試劑盒(上海貝博生物有限公司)；ADAM17抗體(美國Abcam公司)，β-actin、cyclin D1、p21抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；Annexin-V FITC/PI染料試劑盒(美國Sigma公司)；HR標記山羊抗兔IgG二抗、DAB顯影液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；酶標儀(上海BIO-RAD公司)；流式細胞儀(FACS Calibuar，美國BD 公司)；垂直電泳系統(tǒng)、濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)(北京六一儀器廠)。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組轉(zhuǎn)染 HT29細胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃孵育箱中培養(yǎng)。ADAM17小干擾RNA(ADAM17-shRNA)及對照序列(nonsense shRNA)由上海吉瑪公司合成，其序列分別為5′-GCATCATGTATCTGAACAACG-3′、5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。將細胞分為3組，沉默組和陰性對照組分別轉(zhuǎn)染ADAM17-shRNA、nonsense shRNA,空白對照組加入等量PBS，轉(zhuǎn)染后48 h熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。確定MOI值為100時，細胞轉(zhuǎn)染率可達90%以上。

1.3 細胞ADAM17 mRNA檢測 采用real-time PCR法。收集各組細胞，TRIzol法提取RNA。通過Go ScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，然后進行qRT-PCR。ADAM17引物序列上游為5′-ATCAAACCTTTCCTGCG-3′、下游為5′-CAAACCCATCCTCGTCCA-3′，GAPDH引物序列上游為5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、下游為5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。反應條件：95 ℃變性2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；總共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算ADAM17 mRNA相對表達量。每組設(shè)2個復孔，平行實驗3次。

1.4 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8 法。取各組對數(shù)生長期細胞，制成單細胞懸液；以1×104/孔接種于96孔板中(每組設(shè)9個復孔)，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，加入完全培養(yǎng)基100 μL/孔。每孔加入CCK-8工作液10 μL后置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，酶標儀測定在450 nm處的光密度(OD值)。同時設(shè)置空白孔、對照孔、實驗孔，實驗重復3次。細胞增殖率=(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.5 細胞周期觀察 取各組對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板；細胞同步化后胰酶消化，離心收集細胞；PBS清洗1次，然后用含75%乙醇的PBS在4 ℃固定過夜。分析前用PBS 離心洗滌細胞，加入10 mg/L 的RNase A 1 μL，37 ℃ 孵育 30 min；PI(終濃度為50 μg/mL)浸染15 min后,300目濾網(wǎng)過濾細胞懸液，上流式細胞儀檢測。以上實驗重復3次。

1.6 細胞ADAM17、cyclin D1、p21蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組細胞，RIPA裂解液4 ℃裂解30 min，離心收集蛋白。BCA法定量總蛋白，加入等體積2×蛋白上樣緩沖液后100 ℃變性5 min，-80 ℃保存?zhèn)溆?。進行SDS-PAGE蛋白電泳(120 V，60 min)，轉(zhuǎn)膜(90 V，45 min)，10%脫脂奶封閉，一抗搖床孵育過夜(1∶1 000) ，二抗(1∶1 000)37 ℃ 孵育2 h，熒光顯色。Image J軟件分析灰度值。相關(guān)蛋白表達量以所測蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值比值表示。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞ADAM17 mRNA及蛋白表達比較 見表1。

表1 各組細胞ADAM17 mRNA及蛋白表達比較

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與陰性對照組比較，#P<0.01。

2.2 各組細胞增殖情況比較 沉默組、陰性對照組和空白對照組細胞增殖率分別為64.71%±5.14%、99.04%±2.88%、100%，沉默組細胞增殖率低于其他兩組(P均<0.01)，陰性對照組和空白對照組細胞增殖率比較差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 各組細胞周期比較 見表2。

表2 各組細胞周期比較

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與陰性對照組比較，#P<0.01。

2.4 各組細胞cyclin D1、p21蛋白表達比較 見表3。

表3 各組細胞cyclin D1、p21蛋白表達比較

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與陰性對照組比較，#P<0.01。

3 討論

結(jié)腸癌的發(fā)生是遺傳、飲食、環(huán)境、生活習慣及腸道微生態(tài)等多因素共同作用的結(jié)果，在我國發(fā)病率呈逐年上升且年輕化趨勢[5]。由于相關(guān)預防保健知識的缺乏，在我國及其他發(fā)展中國家，大多數(shù)結(jié)腸癌患者在發(fā)現(xiàn)時已處于疾病中晚期，喪失手術(shù)機會。因此，分子靶向治療在晚期腫瘤治療中的運用，已經(jīng)成為治療的新關(guān)注點[6]。

近年來，ADAM17在腫瘤中的作用越來越受到關(guān)注[7]。研究[8, 9]發(fā)現(xiàn)，有著水解剪切酶類功能的ADAM17蛋白，在胃癌、乳腺癌等腫瘤組織中呈明顯高表達狀態(tài)，并可以通過MEK/ERK、PI3K/AKT等信號通路調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。在結(jié)腸癌中，也有相關(guān)報道指出高表達的ADAM17與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移及預后密切相關(guān)[10]。因此，ADAM17作為一個靶向蛋白，在結(jié)腸癌的治療中極具潛力。

無限增殖以及不受調(diào)控的細胞周期是腫瘤惡性病因之一，故腫瘤也被認為是一種細胞周期性疾病，這也是目前大多數(shù)化療藥物以及分子靶向藥物研究的重點[11]。細胞周期蛋白是調(diào)節(jié)G1期與S期間調(diào)控點的關(guān)鍵蛋白，與細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)共同調(diào)控細胞周期[12,13]。p21可以通過與CDK蛋白競爭性結(jié)合cyclin D1，導致cyclin D1/CDK激酶失活，從而產(chǎn)生細胞G0/G1期阻滯[14]。本研究結(jié)果顯示，沉默ADAM17蛋白后，結(jié)腸癌細胞出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯，細胞周期關(guān)鍵蛋白cyclin D1表達顯著降低，而p21的表達則明顯升高。這與Lv等[15]的研究結(jié)果相符。因此，沉默ADAM17可能通過下調(diào)p21影響cyclin D1，產(chǎn)生對結(jié)腸癌細胞周期的抑制作用，從而阻斷細胞從G1期向S期進展，造成G1期細胞堆積[16]。

綜上所述，沉默ADAM17 蛋白能夠抑制細胞的增殖，同時產(chǎn)生HT29細胞G0/G1期阻滯作用。其機制可能是通過影響細胞周期蛋白p21、cyclin D1實現(xiàn)對結(jié)腸癌HT29細胞周期的調(diào)控作用，但這可能并不是ADAM17調(diào)控細胞周期的惟一作用位點，其上游信號通路將在后續(xù)實驗中驗證。

：

[1] Szkandera J, Pichler M, Absenger G, et al. A functional germline variant in GLI1 implicates hedgehog signaling in clinical outcome of stage Ⅱand Ⅲcolon carcinoma patients[J]. Clin Cancer Res, 2014,20(6):1687-1697.

[2] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[3] 吳衡.ADAM17在胰腺癌細胞中的表達及其對細胞增殖遷移的影響[J].江蘇大學學報(醫(yī)學版),2015,25(4):299-303.

[4] Zhang TC, Zhu WG, Huang MD, et al. Prognostic value of ADAM17 in human gastric cancer[J]. Med Oncol, 2012,29(4):2684-2690.

[5] Espejo-Herrera N, Gracia-Lavedan E, Boldo E, et al. Colorectal cancer risk and nitrate exposure through drinking water and diet[J]. Int J Cancer, 2016,139(2):334-346.

[6] Lei J, Yan L. Outcome comparisons among the Hangzhou, Chengdu, and UCSF criteria for hepatocellular carcinoma liver transplantation after successful downstaging therapies[J]. J Gastrointest Surg, 2013,17(6):1116-1122.

[7] Zheng X, Jiang F, Katakowski M, et al. ADAM17 promotes glioma cell malignant phenotype[J]. Mol Carcinog, 2012,51(2):150-164.

[8] Xiao LJ, Lin P, Lin F, et al. ADAM17 targets MMP-2 and MMP-9 via EGFR-MEK-ERK pathway activation to promote prostate cancer cell invasion[J]. Int J Oncol, 2012,40(5):1714-1724.

[9] Meng X, Hu B, Hossain MM, et al. ADAM17-siRNA inhibits MCF-7 breast cancer through EGFR-PI3K-AKT activation[J]. Int J Oncol, 2016,49(2):682-690.

[10] Xu Q, Ying M, Chen G, et al. ADAM17 is associated with EMMPRIN and predicts poor prognosis in patients with uterine cervical carcinoma[J]. Tumour Biol, 2014,35(8):7575-7586.

[11] Jimenez J, Bru S, Ribeiro MP, et al. Phosphate: from stardust to eukaryotic cell cycle control[J]. Int Microbiol, 2016,19(3):133-141.

[12] Tajitsu Y, Ikeda R, Nishizawa Y, et al. Molecular basis for the expression of major vault protein induced by hyperosmotic stress in SW620 human colon cancer cells[J]. Int J Mol Med, 2013,32(3):703-708.

[13] Bertoli C, Skotheim JM, de Bruin RA. Control of cell cycle transcription during G1and S phases[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2013,14(8):518-528.

[14] Karimian A, Ahmadi Y, Yousefi B. Multiple functions of p21 in cell cycle, apoptosis and transcriptional regulation after DNA damage[J]. DNA Repair (Amst), 2016,42:63-71.

[15] Lv X, Li Y, Qian M, et al. ADAM17 silencing suppresses the migration and invasion of non-small cell lung cancer[J]. Mol Med Rep, 2014,9(5):1935-1940.

[16] 林鋒,林平,劉鑫,等.靶向ADAM17基因siRNA對前列腺癌PC-3細胞增殖能力的影響[J].中華男科學雜志,2012,18(8):687-691.