劉燕，劉鈞，何欣蓉，陳筱莉，蹇順海，張超，李學(xué)農(nóng)

(1川北醫(yī)學(xué)院，四川南充637000；2南方醫(yī)科大學(xué))

miR-101是微小RNA(miRNA)家族中的一員，具有高度保守的成熟序列。研究表明，miR-101在多種實(shí)體瘤如乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、骨肉瘤等組織中表達(dá)下調(diào)，與其靶基因在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移、侵襲轉(zhuǎn)移及其他過程中起著一定作用。在胰腺癌組織中，miR-101通過靶向作用于高遷移率族蛋白A2(HMGA2)而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[1]；在骨肉瘤細(xì)胞中，miR-101靶向抑制c-FOS來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-101能夠阻滯結(jié)直腸癌細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并可靶向調(diào)控Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(Rac1)表達(dá)[3～5]。在食管癌、卵巢上皮癌、胎兒型橫紋肌肉瘤、肝癌及侵襲性子宮內(nèi)膜癌等腫瘤細(xì)胞中，miR-101通過下調(diào)EZH2表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并能提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[6～9]。2014年1月～2016年6月，我們觀察了miR-101對(duì)結(jié)直腸癌放療敏感性的影響，并探討其分子機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620、SW480由本實(shí)驗(yàn)保存，穩(wěn)定過表達(dá)miR-101細(xì)胞株SW620(miR101-SW620)及其陰性對(duì)照GV209-SW620、穩(wěn)定沉默miR-101表達(dá)細(xì)胞株SW480(SW480-miR101)及其陰性對(duì)照SW480-NC由本課題組前期構(gòu)建。

1.1.2 試劑 RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Hyclone公司；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒均購買于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，配膠試劑盒和抗體稀釋液均購買于碧云天生物科技研究所；上樣緩沖液和脫脂奶粉均購買于廣州威佳科技有限公司；Rac1、細(xì)胞分裂周期蛋白42(Cdc42)、人Ras同源基因家族成員A(RhoA)、DNA損傷標(biāo)志性蛋白γ-H2AX、細(xì)胞凋亡標(biāo)志性蛋白Caspase-3一抗購買于Epitomics公司，鼠抗人α-GAPDH、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠和抗兔IgG(H+L)二抗均購買于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蛋白預(yù)染Marker和超敏發(fā)光液均購買于美國Fermentas公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480、SW620、miR101-SW620、GV209-SW620、SW480-miR101、SW480-NC均接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37 ℃ 5% CO2下進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞中Rac1、RhoA、Cdc42蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。收集各型直腸癌細(xì)胞，用PBS洗滌3次，加入蛋白裂解液，冰上放置30 min，超聲裂解10次左右。于4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，吸出上清將其移至一新的1.5 mL Ep管中，使用BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。分別配制10%、12%SDS-PAGE的分離膠與5%SDS-PAGE的濃縮膠，每泳道上樣量為30 μg總蛋白；與5×SDS上樣緩沖液按4∶1混合，沸水煮5 min，冰上放置2 min。上樣后進(jìn)行電泳，濃縮膠使用恒壓80 V，30 min；分離膠使用恒壓100 V，60 min。拆分凝膠夾層后，根據(jù)Marker所示條帶位置，準(zhǔn)確切下目的條帶；PVDF膜在甲醇中浸泡1 min，轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜緩沖液(甘氨酸2.9 g、SDS 0.375 g、甲醇200 mL、Tris堿5.8 g，再加水定容至1 000 mL)中浸泡。在轉(zhuǎn)移盒中組裝好轉(zhuǎn)印夾層，由負(fù)極到正極依次放入海綿墊、2層濾紙、凝膠、PVDF膜、2層濾紙和海綿墊。使用Bio-Rad微型電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(150 mA)于冰上進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，直到目的蛋白對(duì)應(yīng)的Marker轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜從轉(zhuǎn)移夾層中取出，甲醇中浸泡1 min，置于濾紙上使其充分干燥。再把膜放置到甲醇中10 s，再將膜放置于清水中清洗3 min。將膜放入含有封閉液(用5%脫脂奶粉配制的PBST)的平皿中，室溫下?lián)u床上緩慢搖動(dòng)孵育1 h；取出PVDF膜，加入一抗后于4 ℃冰箱孵育過夜。次日取出膜，室溫下孵育30 min；用25 mL PBST進(jìn)行3次洗膜，每次5～10 min。加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫下?lián)u床上緩慢搖動(dòng)孵育1 h；用PBST進(jìn)行3次洗膜，每次5～10 min，最后使用Tanon化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行發(fā)光。以目的蛋白與內(nèi)參光密度比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞照射與敏感性觀察 采用Siemens PRIMUS直線加速器，6 MV X射線照射，源皮距為100 cm，吸收劑量率為200 cGy/min，培養(yǎng)板(瓶)上覆蓋1.5 cm厚的補(bǔ)償膠(模擬皮膚)，培養(yǎng)板(瓶)置于水槽之上。取SW620、GV209-SW620、miR101-SW620細(xì)胞，分別給予0、2、4、6、8 Gy射線處理24 h，采用Western blotting法檢測(cè)γ-H2AX、Caspase-3，以其相對(duì)表達(dá)量判斷細(xì)胞放療敏感性變化，檢測(cè)方法同1.3。

1.5 照射后細(xì)胞Rac1、 RhoA、Cdc42蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法，方法同1.3。

2 結(jié)果

2.1 miR-101對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞Rac1、RhoA、Cdc42蛋白表達(dá)的影響 與SW620、GV209-SW620細(xì)胞比較，穩(wěn)定過表達(dá)miR-101的miR101-SW620細(xì)胞Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表達(dá)均降低(P均﹤0.05)；與SW480、SW480-NC細(xì)胞比較，沉默miR-101表達(dá)的SW480-miR101細(xì)胞Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表達(dá)均增高(P均﹤0.05)。見表1。

表1 miR-101對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表達(dá)的影響

注：與SW620、GV209-SW620比較，*P<0.05；與SW480、SW480-NC比較，#P<0.05。

2.2 miR-101對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞放療敏感性的影響 隨著照射劑量增加，結(jié)直腸癌細(xì)胞γ-H2AX、Caspase-3表達(dá)均增高(P均﹤0.05)；與同等照射劑量下SW620、GV209-SW620細(xì)胞比較，穩(wěn)定過表達(dá)miR-101的miR101-SW620細(xì)胞γ-H2AX、Caspase-3蛋白表達(dá)均增高(P均﹤0.05)。見表2。

2.3 miR-101對(duì)照射后細(xì)胞Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表達(dá)的影響 隨著照射劑量增加，結(jié)直腸癌細(xì)胞Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表達(dá)均降低(P均﹤0.05)；與同等照射劑量下SW620、GV209-SW620細(xì)胞比較，穩(wěn)定過表達(dá)miR-101的miR101-SW620細(xì)胞Rac1、RhoA、Cdc42蛋白表達(dá)均降低(P均﹤0.05)。見表2。

3 討論

miRNA是非編碼小分子RNA家族，轉(zhuǎn)錄后可通過堿基互補(bǔ)方式與靶向蛋白編碼基因mRNA的3′UTR結(jié)合，引起其降解或抑制其翻譯，發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用。人類基因組中約1/3的蛋白編碼基因受miRNA調(diào)控，參與細(xì)胞增殖、代謝、分化、周期及個(gè)體發(fā)育等生命活動(dòng)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著照射劑量的增加，各型結(jié)腸癌細(xì)胞γ-H2AX蛋白表達(dá)水平增加，表明其DNA雙鏈斷裂(DSBs)程度加??；而在同一劑量照射時(shí)，過表達(dá)miR-101的結(jié)腸癌細(xì)胞γ-H2AX蛋白表達(dá)水平增加更顯著，提示其DSBs程度加劇。Rogakou等[10]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在受到電離輻射作用時(shí)，能迅速磷酸化H2AX保守羧基端尾部的Ser139殘基，從而形成γ-H2AX，由此可見DSBs能誘導(dǎo)產(chǎn)生γ-H2AX。從分子水平表明，miR-101可能增加結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞的放療敏感性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細(xì)胞隨著照射劑量的增加，Caspase-3表達(dá)增加；并且，過表達(dá)miR-101的結(jié)腸癌細(xì)胞，Caspase-3表達(dá)水平增加最明顯。這從蛋白水平表明，miR-101可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。

表2 照射后各型結(jié)腸癌細(xì)胞γ-H2AX、Caspase-3、Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表達(dá)比較

注：與SW620、GV209-SW620同照射劑量比較，*P﹤0.05；與同類型細(xì)胞上一照射劑量比較，#P﹤0.05。

Bao等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-101通過調(diào)控MAPK/Erk及Smad信號(hào)通路抑制膽囊癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。而miR-101是如何調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的放療敏感性，有待進(jìn)一步研究。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-101的靶基因是Rac1，過表達(dá)miR-101后Rac1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均下調(diào)；沉默miR1-101后，Rac1的mRNA和蛋白水平表達(dá)均上調(diào)。進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-101靶向調(diào)控Rac1，可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控Rac1的表達(dá)[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-101可降低結(jié)腸癌細(xì)胞Cdc42、RhoA蛋白表達(dá)，而抑制miR-101表達(dá)后Cdc42、RhoA蛋白表達(dá)水平上調(diào)，其結(jié)果與Rac1一致。這表明miR-101可能通過Rac1/Cdc42/RhoA通路來調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。取SW620、GV209-SW620、miR101-SW620細(xì)胞，分別給予0、2、4、6、8 Gy射線處理24 h；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著照射劑量增加，結(jié)直腸癌細(xì)胞Rac1蛋白表達(dá)降低；同一劑量下，過表達(dá)miR-101的結(jié)直腸癌細(xì)胞Rac1蛋白表達(dá)水平下降更為明顯。這表明miR-101可能是通過調(diào)控Rac1來增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的放療敏感性。同時(shí)，檢測(cè)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)Cdc42和RhoA的蛋白表達(dá)水平與Rac1一致，表明miR-101增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的放療敏感性可能與Rac1/Cdc42/RhoA通路密切相關(guān)。Rho家族屬于Ras超家族, 主要成員有Rac、Cdc42和Rho(包括RhoA、B和C)三個(gè)亞家族。Rac1是Rho-GTPase家族的主要成員之一，其與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲，細(xì)胞凋亡、周期調(diào)控和腫瘤新生血管的形成密切相關(guān)[12，13]?；罨腞ac1能引起肌動(dòng)蛋白微絲聚集于質(zhì)膜上，產(chǎn)生片狀偽足和膜多極化，從而促進(jìn)腫瘤的生長轉(zhuǎn)移和侵襲[12]。Thomas等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在髓系白血病中，通過下調(diào)Rac1/Cdc42蛋白的表達(dá)后，RhoA的表達(dá)活性受到抑制，從而抑制了p210-BCR-ABL介導(dǎo)的髓系白血病的增殖，表明Rac1/Cdc42/RhoA通路與髓系白血病的增殖密切有關(guān)。RhoA家族屬于Ras超家族中小分子量G蛋白。研究表明，在結(jié)腸癌、肺癌和肝癌等多種實(shí)體瘤中RhoA家族表達(dá)異常，與腫瘤的增殖、分化、黏附、侵襲性增加和異常定位等生物學(xué)行為密切相關(guān)[15，16]。目前已經(jīng)證實(shí)，RhoA蛋白在肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中均呈過表達(dá)，并作為乳腺癌重要的預(yù)后指標(biāo)[17，18]。因此，我們推測(cè)miR-101可能是通過Rac1/Cdc42/RhoA通路調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，而miR-101是如何調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞增強(qiáng)其對(duì)放療的敏感性，還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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