徐為民，時景偉，孫 志

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033)

丹參具有擴張冠脈、防治心肌缺血、心肌梗死、改善微循環(huán)和降低心肌耗氧等作用，目前已被廣泛應用于心血管疾病的治療[1]。丹參提取物的主要有效成分包括丹參酮IIA、丹參素和丹酚酸三類。其中丹參多酚屬丹酚酸類，具有清除自由基和抑制氧化酶樣活性，故具有抗纖維化的藥理基礎(chǔ)。本實驗從組織學變化角度觀察丹參多酚對異丙腎上腺素致小鼠心肌纖維化模型的改善作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

注射用丹參多酚酸鹽(上海綠谷制藥有限公司)，鹽酸異丙腎上腺素注射液(上海豐禾制藥有限生公司生產(chǎn))，Trizol試劑，逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司)，DNA聚合酶，TECHNE TC-312 PCR 擴增儀(英國)，凝膠圖像處理系統(tǒng)(Tanon GIS-1000，上海)，DHE(二氫乙啡啶，美國Sigma公司)，DAPI封片劑(美國Sigma公司)，冰凍切片機(德國)，激光共聚焦顯微鏡(尼康A(chǔ)1R)。

1.2 實驗動物造模與分組

雄性CD1小鼠30只，體重17-25 g(由吉林大學實驗動物中心提供)。分為正常對照組，模型組和丹參多酚組。每組10只適應性喂養(yǎng)1周，予模型組及丹參多酚組皮下注射異丙腎上腺素(10 mg/kg)復制心肌纖維化模型，丹參多酚組同時給予丹參多酚(8 mg/kg/天)尾靜脈注射。四周后處死小鼠，收集心臟常規(guī)制備石蠟切片，行HE染色、天狼星紅染色及UII(尾加壓素Ⅱ)mRNA、UT(尾加壓素受體)mRNA半定量RT-PCR。

1.3 氧化應激原位檢測

各組取部分心臟做冰凍切片，厚度10 μm。切片滴入DHE(1 μmol/L)，避光孵育5 min，PBS沖洗后，用水溶性封片劑(含DAPI)封片，在激發(fā)光波長分別為405 nm及561 nm的激光共聚焦顯微鏡下觀察藍色細胞核及紅色活性氧分子，每組隨機取5個畫面，應用Image J圖像分析系統(tǒng)分析紅色熒光強度(平均光度值和熒光面積)，評估氧化應激情況。

1.4 RT-PCR

Trizol 提取心臟總RNA，各取1 μg mRNA以oligo dT為引物在SuperⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank中登錄的小鼠內(nèi)參對照物GAPDH、UII及tGPR14 mRNA序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，GAPDH內(nèi)參基因上游5’-ACCACAGTCCATGCCATC AC-3’，下游5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’； UII：Sense：5’-GAGCATTCCCTTCATCGTAG -3’Anti-sense：5’-CATAGCGTTCACTGCTCATT-3’，UT：Sense：5’-CTTTCACTCAGCACCTCAT -3’Anti-sense：5’-CTTAGTTTTTCTCCACACTGTT -3’。擴增產(chǎn)物長度分別為452 bp 、385 bp和211 bp。取5μl PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線透射反射分析儀上拍照。每組隨機取5個心臟進行上述步驟。UII、UT表達量以UII、UT灰度值來表示，應用ImageJ測算灰度值并做統(tǒng)計分析。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

對照組心肌排列整齊，橫紋清晰，細胞核大小一致。模型組心肌細胞腫脹，細胞核大小不一，排列紊亂，可見纖維增生。丹參多酚組則組織壞死和纖維化程度較模型組明顯減輕。見圖1。

2.2 天狼星紅熒光染色結(jié)果

正常對照組無明顯膠原纖維紅染，模型組可見大片致密亮紅色膠原纖維，與背景對比明顯，丹參多酚組紅染膠原纖維數(shù)量較模型組明顯減少。見圖2。

圖1 HE染色結(jié)果(200X) A:對照組，B:模型組，C:丹參多酚組

圖2 天狼星紅染色結(jié)果(200X) A:對照組，B:模型組，C:丹參多酚組

2.3 DHE熒光染色結(jié)果

正常對照組可見極少量散在點狀活性氧分泌，模型組活性氧明顯增多，丹參多酚組較模型組明顯減少。見圖3、表1。

圖3 DHE染色結(jié)果(600X) A:對照組，B:模型組，C:丹參多酚組。藍色為細胞核，紅色為DHE標記的活性氧。

組別平均灰度值面積百分比正常對照組797.46±6.540.11±0.02模型組795.74±9.561.14±0.04**丹參多酚組796.68±8.220.60±0.11##

2.4 UII 及UTmRNA表達

RT-PCR結(jié)果顯示，四周時模型組 UII mRNA及UT表達均明顯增高(P<0.01)，治療組有所下降但仍高于正常對照組(P<0.01)。見圖4，表2。

圖4 UII 及UTmRNA的表達 1：DNA marker,2：對照組，3：模型組，4：丹參多酚組

平均灰度值UⅡUT累積密度UⅡUT正常對照組60.24±3.9554.72±5.088331±192.813572.2±567.6模型組226.46±8.26**177.78±8.60** 28177±662.5**42414.2±619.6**丹參多酚組151.50±9.23##124.10±5.72## 24334±1066.8##32692.0±603.6##

3 討論

植物提取物對UII誘導的心肌纖維化具有改善作用，這已在多個研究中被證實[2，3]，丹參因具有抗氧化應激作用[1]，而氧化應激是心肌纖維化的主要機制[4]，可能為活性氧參與前纖維蛋白1抗體的表達及Akt-ERK-eNOS信號系統(tǒng)的活化[5]。故丹參延緩心肌纖維化進程在理論上是可行的，本實驗通過小鼠組織學變化證實了該理論。

在本研究中，丹參多酚在減少膠原和心肌壞死范圍上均起到顯著作用，同時也使UII的表達明顯減少，UII則是多個試驗證實的與纖維化明確相關(guān)的因素之一[6,7]。

本實驗中丹參多酚能夠減少活性氧的產(chǎn)生，從而減輕氧化應激程度?；钚匝跏侵干矬w內(nèi)含有氧原子且性質(zhì)活潑的一類物質(zhì)的總稱，主要包括超氧陰離子自由基(O2-)、過氧化氫(H2O2)、單線態(tài)氧分子(1O2)、羥自由基(OH-)、過氧化脂質(zhì)(ROO-)和次氯酸鹽(ClO-)等，活性氧主要是由分子氧經(jīng)線粒體呼吸鏈電子傳遞產(chǎn)生，能通過氧化應激促發(fā)機體的氧化損傷，并作為第二信使參與多種疾病的調(diào)節(jié)[8]，是導致心肌纖維化的主要機制。目前熒光法是較為靈敏及易操作的活性氧檢測方法。

本實驗應用的DHE主要用來標定超氧陰離子，在心肌細胞內(nèi)超氧陰離子作用下，DHE能被特定波長的激光激發(fā)而顯示紅色熒光[9,10]。在本實驗可以看到，Sham組心肌也顯示出一定的紅色熒光，顯示在心肌組織有其他的自發(fā)熒光成分，在一定程度上影響的實驗的客觀性。另有研究利用DHE染色離體心肌細胞獲得較強熒光信號[11]，間接說明活性氧代謝速度快，利用組織切片技術(shù)獲得的活性氧信號弱于細胞培養(yǎng)技術(shù)。

丹參多酚酸鹽成分相對單一，質(zhì)量穩(wěn)定，故不良反應相對較少，且價格相對低廉。希望本研究可以為更多中藥制劑治療心肌纖維化提供依據(jù)。

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