鐘太清，李毓龍，劉寶濤，蘇維奇*

(1.青島大學(xué)附屬青島市立醫(yī)院 檢驗科，山東 青島266071；2.簡陽市人民醫(yī)院 檢驗科；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院)

血流感染(BSI)是一種嚴重的全身感染性疾病，依發(fā)病場所分為社區(qū)獲得性血流感染(CABSI)及醫(yī)院獲得性血流感染(HABSI)，資料顯示美國每年血流感染占衛(wèi)生保健相關(guān)感染的10%-20%，病死率約為17%[1]。中國醫(yī)院內(nèi)感染的抗菌藥物耐藥監(jiān)測項目(CARES)結(jié)果顯示肺炎克雷伯菌(占比14.8%)是重要的血流感染病原菌，僅次于大腸埃希菌(占比31.0%)，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素耐藥率約為11%[1]，是臨床血流感染性疾病治療的巨大挑戰(zhàn)。本研究旨在分析我院2016年1月-2017年7月醫(yī)院獲得性血流感染患者來源的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)的耐藥特點及機制，為臨床循證用藥，改善醫(yī)院獲得性碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌血流感染患者的預(yù)后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象收集2016年1月-2017年7月我院住院患者血培養(yǎng)陽性病原菌株，經(jīng)鑒定為CRKP共11株(剔除重復(fù))。菌株篩選標準：至少1份血標本分離出典型的病原菌，且與其他部位感染無關(guān)；有血流感染癥狀；血標本送檢時入院時間>48 h。菌株經(jīng)BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)GNI卡進行細菌/藥敏鑒定，K-B瓊脂紙片擴散法及E-test進行體外藥敏補充實驗。

1.2儀器與試劑BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)(美國BD公司)，Bio-Rad 170電泳儀、Bio-Rad T100PCR儀及Gel凝膠成像系統(tǒng)[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]，Oxoid藥敏紙片(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)。PCR試劑盒(大連Takara生物工程有限公司)，引物合成及PCR產(chǎn)物測序由上海派森諾生物科技股份有限公司執(zhí)行。質(zhì)控菌株：肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705 、ATCC BAA1706由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)劉寶濤老師饋贈。

1.3方法

1.3.1菌株鑒定/藥敏實驗 所有菌株經(jīng)BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)(美國BD公司)ID-GN及AST-GN卡進行細菌/藥敏鑒定，碳青霉烯類耐藥表型通過亞胺培南試紙條E-test法進行測定[2]，結(jié)果按照美國臨床實驗室標準化委員會CLSI2015標準判定。肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705 、ATCC BAA1706作為質(zhì)控菌株。所有操作按照本實驗室SOP及《全國臨床檢驗操作規(guī)程(第四版)》進行。對頭孢菌素類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、喹諾酮類、含酶抑制劑的β-內(nèi)酰胺類藥物中的3類或者3類以上耐藥者判定為多重耐藥(muiti-drug resistance，MDR)。對目前推薦用于細菌感染經(jīng)驗治療的藥物(不包括多黏菌素等)均耐藥者視為泛耐藥( pan-drug resistance，PDR)。

1.3.2耐藥基因檢測 細菌DNA提取采用煮沸法，保存于-20℃。所有菌株檢測KPC、 NDM 、BIC、SPM、IMP、 AIM、 VIM 、OXA 、GIM、 SIM、DIM等基因，引物設(shè)計及反應(yīng)條件參考文獻[3,4],PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并用Gel凝膠成像系統(tǒng)照相留存結(jié)果。

1.3.3MLST分析 肺炎克雷伯菌MLST分型參考Institut Pasteur’s MLST計劃[5]數(shù)據(jù)庫。

1.3.4質(zhì)粒接合實驗及分型 液相接合實驗依文獻[6]所述方法，受體菌為鏈霉素耐藥的E.coli C600，用含有2 000 μg/ml 鏈霉素+0.8 μg/ml 美洛培南的雙抗麥康凱平板篩選接合子。

1.3.5PCR產(chǎn)物測序 由上海派森諾生物科技股份有限公司ABI 3730XL DNA測序儀完成。

1.3.6系統(tǒng)發(fā)育樹 采用MEGA7.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹圖，分析菌株之間親緣關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1菌株來源2016年1月至2017年7月血培養(yǎng)陽性結(jié)果剔除重復(fù)后共分離菌株2124株，其中CRE共31株，占1.5%，CRKP 11株，占0.5%。本研究中的11株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌來自11個不同患者血液標本，3人來自ICU病房，2人來自呼吸科病房，2人來自急診日間病房，1人來自新生兒科病房，1人來自普外科病房，1人來自老年保健科病房，1人來自神經(jīng)內(nèi)科病房，相關(guān)患者住院期間均有侵入性操作史(表1)。

2.2菌株藥敏結(jié)果11株CRKP均顯示為多重耐藥，尤其是對青霉素類，第三代、第四代頭孢全耐藥；3號、7號菌株對亞胺培南中介，對美洛培南耐藥；6號菌株對亞胺培南敏感，對美洛培南中介，其對復(fù)方新諾明也敏感；9號菌株對美洛培南中介，對亞胺培南耐藥；3號、6號菌株對阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明均敏感；9號菌株對阿米卡星敏感，對慶大霉素耐藥。所有菌株均產(chǎn)ESBL，但對多粘菌素全敏感(MIC≤0.5)(表2)。

2.3耐藥基因及分子分型PCR及測序分析碳青霉烯耐藥基因，經(jīng)鑒定10株為KPC，1株為NDM。同時，1、2、3、4號菌株檢出blaCTX-M-6群基因，4、5、7號菌株檢出armA基因，5、8、10號菌株檢出qnr基因。用MLST進行基因分型結(jié)果顯示，1、2號菌株鑒定為ST15，3、4、7號菌株鑒定為ST2250，5、11號菌株菌株鑒定為ST2193,6號菌株鑒定為ST1083,8、9、10號菌株為ST23。為進一步研究碳青霉烯耐藥傳播機制，以E.coli C600為受體菌進行液相接合實驗，接合成功4株，對原菌及對應(yīng)接合菌進行藥敏分析，結(jié)果見下表(表3)，接合效率為9×10-7-2.5×10-5cfu/受體菌。對接合子進行PCR分析確定與相應(yīng)供體菌碳青霉烯基因型相同。各菌株之間親緣關(guān)系用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。

表1 碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌臨床資料及分子特征

表2 碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯桿菌藥敏結(jié)果分析

3 討論

在臨床微生物實驗室中，細菌血癥和真菌血癥的檢測仍然是最重要、最復(fù)雜的角色之一，血培養(yǎng)結(jié)果可以指導(dǎo)抗生素治療和后續(xù)的手術(shù)治療、拔除導(dǎo)管的方案和其他的臨床干預(yù)措施，在CRKP感染是導(dǎo)致治療失敗和死亡的背景下這種價值更為突出。

表3 接合原菌及接合菌特性及藥敏結(jié)果

本文研究了2016年1月至2017年7月從青島市立醫(yī)院醫(yī)院獲得性血流感染患者分離的11株CRKP的藥敏及耐藥特征，其中2016年分離出4株，2017年分離出7株，分離率有增高趨勢。分析采樣日期發(fā)現(xiàn)菌株分離時段主要在冬季，其次為夏季，有學(xué)者認為一年中最熱的幾個月肺炎克雷伯菌血流感染分離率是平時的1.5倍[7]，本研究與此不符，可能原因為樣本量少或CRKP分離率不同于KP分離率，與本地流行水平相關(guān)。11株CRKP藥敏顯示均為泛耐藥，尤其對第三、第四代頭孢類抗生素全部耐藥，產(chǎn)ESBL， 4株產(chǎn)CTX-M-6群耐藥基因，檢出率36.4%，與臨床大量使用頭孢類抗生素密切相關(guān)；阿米卡星耐藥率72.7%稍低于慶大霉素81.8%，可能與阿米卡星對細菌所產(chǎn)鈍化酶較穩(wěn)定有關(guān)，可以與其他抗生素聯(lián)合應(yīng)用；環(huán)丙沙星與左氧氟沙星耐藥率均>70%，與既往研究相符[8]，臨床應(yīng)限制使用。多粘菌素是一種多肽類抗生素，為慢效殺菌劑，不良反應(yīng)明顯，本研究中多粘菌素100%敏感，在其他抗生素治療效果欠佳時可選用。

圖1 系統(tǒng)發(fā)育樹圖

本研究結(jié)果表明，本院主要流行的CRKP為產(chǎn)KPC型(10/11)，與既往資料相符[8]。產(chǎn)KPC型CRKP主要是從ICU、呼吸病房、急診日間病房分離出來，且這些患者住院期間均有侵入性操作這一危險因素，結(jié)合藥敏結(jié)果及CTX、armA、qnr等耐藥基因綜合分析，本研究顯示長期護理單元和相同病區(qū)的護理單元易分離出攜帶相同耐藥基因的CRKP，與既往研究結(jié)果一致[9]，提示KPC、CTX等可能是通過基因水平傳播獲得。為進一步驗證此種假設(shè)，我們進行了液相接合實驗，1、2、4、10號菌KPC基因可液相接合，位于質(zhì)粒上，且CTX-M-6基因可與KPC基因位于同一質(zhì)粒上。根據(jù)MLST分型結(jié)果，1、2號菌均為ST15，系統(tǒng)發(fā)育樹圖顯示親緣關(guān)系為100%,可以推定為同一克隆。3、4、7號菌均分離自ICU病房，采樣日期相近，且均為ST2250，4、7號菌均攜帶KPC、armA基因，親緣關(guān)系>90%,3、4號菌均攜帶KPC、CTX基因，4號菌攜帶KPC、CTX、armA基因，可能為3、7號菌相關(guān)耐藥基因水平傳播、嵌合后的子代，雖需要進一步證據(jù)支持，但4號菌接合成功證明KPC存在于接合質(zhì)粒，共軛傳播CTX產(chǎn)KPC酶和CTX-M-6群耐藥基因共存在本研究得到證實。8、10號菌分離自急診日間病房，均攜帶KPC、qnr基因，為ST23，親緣關(guān)系>95%,可能為耐藥基因水平傳播所致，已有研究觀察到產(chǎn)KPC型CRKP嵌合qnr后一起水平傳播，更有甚者可以分配到多重耐藥高風險的CC-258中去[10]，這種水平轉(zhuǎn)移傳播的特點是CRKP多次大規(guī)模流行的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)?？紤]到產(chǎn)酶基因亦可由轉(zhuǎn)座子、整合子等其他可移動元件介導(dǎo)，具體傳播路徑有待進一步研究。

作者簡介：鐘太清(1990-)，男，在讀碩士，研究方向：細菌耐藥機制及分子流行病學(xué)研究。

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