段云霞，趙 英，遲玉杰*

雞蛋含有豐富的營養(yǎng)物質，是人類飲食中重要的動物蛋白來源。白煮蛋是人們普遍喜愛的早餐食品，相比于鹵蛋和腌制蛋，其能最大程度地保留鮮蛋的營養(yǎng)成分[1-2]。目前，丹麥的SANOVO公司開發(fā)生產了煮蛋、去殼、分裝系列設備，實現(xiàn)了白煮蛋的工業(yè)化生產。工業(yè)化生產的白煮蛋在方便食品、航空食品、快餐行業(yè)等食品領域具有廣闊的市場空間。但是白煮蛋是一種容易腐敗變質的食品，在貯藏中會出現(xiàn)硬度增大、變色等品質問題[3]。因此，研究不同貯藏條件下白煮蛋的品質變化并探尋品質變化原因，可為延長白煮蛋的貨架期提供理論依據(jù)。

低場核磁共振（low field-nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術被廣泛應用于食品領域，通過測定水分子的弛豫特性T2、水分的分布及其與食品組分的結合狀態(tài)進而判斷食品中自由水、結合水、不易流動水的移動性和分布情況[4]，有利于進一步分析水分對食品品質的影響。目前，LF-NMR技術已被廣泛應用于肉制品[5-6]、果蔬[7]、面制品[8]等食品領域，在蛋制品領域的應用逐漸成熟[9-10]。劉斯琪等[11]利用NMR研究鴨蛋黃品質變化時發(fā)現(xiàn)，食鹽會改變蛋黃內部水分遷移及分布，導致質構性質改變，進而影響蛋黃的品質。林向陽等[12]利用NMR研究室溫和冷藏條件下雞蛋腐敗過程，發(fā)現(xiàn)雞蛋腐敗過程中，其理化性質與弛豫特性存在相關性，可通過該技術預測雞蛋的貨架期。徐雷等[13]采用LF-NMR技術研究氣調貯藏過程中蛋清的水分變化，結果表明通過二氧化碳氣調貯藏，可有效控制蛋清中不易流動水體積分數(shù)的上升，即抑制蛋白質結合水的能力。本實驗利用LF-NMR技術研究白煮蛋在貯藏期間蛋清及蛋黃的水分分布變化，有助于深入分析白煮蛋表觀品質的變化。

目前關于結合LF-NMR技術研究不同貯藏條件下白煮蛋水分分布及品質變化規(guī)律的報道甚少?；诖?，本實驗利用該技術研究白煮蛋在貯藏期間水分分布變化規(guī)律及品質的變化，旨在拓展此技術在蛋制品品質評價中的應用，通過探尋品質變化原因，為延長白煮蛋的貯藏期提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋購于哈爾濱大潤發(fā)超市；2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenyl hydrazine，DNPH）、2-硫代巴比妥酸美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Mq-20 LF-NMR分析儀 德國布魯克公司；MB35水分測定儀 奧豪斯儀器（常州）有限公司；TA.XT Plus型質構分析儀 英國Stable Micro Systems公司；ZE-6000色差計 日本色電工業(yè)株式會社；MERLIN FE-SEM掃描電子顯微鏡 德國Carl Zeiss Microscopy GmbH公司。

1.3 方法

1.3.1 白煮蛋樣品的制備

挑選質量在65～70 g左右的新鮮雞蛋，清洗、去除表面的污染物，將所有雞蛋在沸水中煮制10 min（水浸沒全部雞蛋），撈出后再用流動水冷卻10 min。隨機挑選一半數(shù)量的白煮蛋手動去殼（要求白煮蛋不破損）。將去殼和帶殼的白煮蛋分別在低溫（4 ℃）和室溫（25 ℃）下貯藏，并對貯藏0、12、24、36、48、60 h的樣品進行各指標測定。

1.3.2 水分體積分數(shù)測定

參照李運通等[8]的方法，分別稱取約3 g蛋清和蛋黃樣品，分割為均勻細小顆粒后置于水分測定儀托盤上，選擇自動模式，測試溫度為105 ℃，測試時間為30 min，測定不同貯藏時間白煮蛋樣品的水分體積分數(shù)。

1.3.3 水分分布測定

參照Aursand等[14]的方法并略作修改，將白煮蛋蛋清和蛋黃切成塊狀放在專用的測定試管中（試管高度18 cm，直徑1.8 cm），LF-NMR分析儀的磁場強度為0.47 T，質子共振頻率為20 MHz。采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill程序測定白煮蛋樣品的橫向弛豫時間T2，對于每一個樣品，測定時自動掃描8 次，每次掃描重復的間隔時間為2 s。測定后的每個樣品T2通過CONTIN軟件進行分析，計算出相應的弛豫時間。

1.3.4 蛋白氧化測定

通過羰基含量分析蛋白氧化情況[15]。將3 g蛋清樣品置于15 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中，均質，離心，過濾后取0.5 mL上清液，并測定其蛋白質量濃度，之后加入0.5 mL 10%（質量分數(shù)，下同）的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液離心，沉淀部分用鹽酸/丙酮溶液（3∶100，V/V）洗滌2 次。向每管中加入1 mL 10 mmol/L的DNPH溶液，空白加入1 mL 2 mol/L HCl溶液（HCl代替DNPH），室溫下靜置1 h（每15 min漩渦振蕩1 次）。添加1 mL 20% TCA溶液，以10 000 r/min離心5 min，棄上清液，用1 mL乙酸乙酯/乙醇（1∶1，V/V）溶液洗滌沉淀3 次，除去未反應的DNPH，加3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液，37 ℃條件下保溫15 min溶解沉淀，10 000 r/min離心3 min除去不溶物質，最后獲得物在370 nm波長處測其吸光度。羰基含量按式（1）進行計算。

式中：A370nm為最后獲得物在370 nm波長處吸光度；ρ為上清液蛋白質量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 脂肪氧化測定

采用硫代巴比妥酸產物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）含量分析脂肪氧化情況。參考Ren Yuan等[16]的方法，略有改動。取約2 g蛋黃樣品放入試管中，加入1.5 mL硫代巴比妥酸溶液，7.5 mL TCA-HCl溶液，混合后沸水浴中反應40 min，冷卻至室溫，取出4 mL樣品溶液與等體積的氯仿混合，3 000 r/min離心10 min，532 nm波長處讀取吸光度，TBARS含量按式（2）計算。

式中：A532nm為樣品在532 nm波長處吸光度；m為樣品質量/g；9.48為常數(shù)。

1.3.6 質構特性的測定

參照Ganasen等[17]的方法，蛋清和蛋黃分別切成20 mm×20 mm×10 mm大小的立方體，使用質構儀（25 ℃）對樣品進行2 次壓縮質構測定。測定參數(shù)為：探頭（p36R）距樣品上表面的高度為8 mm，壓縮程度為50%，觸發(fā)值5 g；測試前速率2 mm/s，測試速率1 mm/s，測試后速率2 mm/s；每個實驗點平行測定6 次，選取硬度和咀嚼性作為分析指標。

1.3.7 掃描電子顯微鏡觀察

參照Zhao Yan等[18]的方法，從蛋清上切下約4 mm×4 mm×2 mm的樣品，室溫下在體積分數(shù)2.5%的戊二醛（0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.8）溶液中固定過夜。隨后，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）沖洗樣品3 次，每次10 min。然后分別用體積分數(shù)50%、70%、80%、90%乙醇溶液進行脫水，每次10 min；再用體積分數(shù)100%乙醇脫水2 次，每次10 min。依次用V（乙醇）∶V（叔丁醇）＝1∶1和體積分數(shù)100%叔丁醇各置換1 次，每次15 min。最后將樣品進行冷凍干燥。挑選截面平緩的樣品粘貼在掃描電子顯微鏡專用的臺面上，對樣品表面進行噴金，用掃描電子顯微鏡進行掃描拍照。

1.3.8 色差值的測定方法

參照Goldner等[19]的方法，略作改動。將蛋清和蛋黃分割成大小均勻的小顆粒，平鋪于比色皿中，將樣品平面對準攝像裝置，小孔徑光束下測定樣品的L*值、a*值和b*值，觀察顏色變化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均設置3 次重復，用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，并用Duncan法進行多重比較；采用Origin Pro 8.0軟件作圖。結果以平均值±標準差表示，以P＜0.05表示差異顯著。樣品分3 批次進行測試，每個樣品做3 個平行。

2 結果與分析

2.1 白煮蛋貯藏過程中水分體積分數(shù)的變化

水分體積分數(shù)是描述食品中水分存在的普遍參數(shù)，與食品的品質有重要關系。不同貯藏條件下白煮蛋的水分體積分數(shù)見圖1。

圖1 貯藏過程中白煮蛋蛋清（a）及蛋黃（b）水分體積分數(shù)變化Fig. 1 Changes in moisture contents of boiled egg white (a) and yolk (b)during storage

由圖1可知，在貯藏期間所有樣品的水分體積分數(shù)整體呈下降的趨勢，且蛋清下降幅度顯著高于蛋黃，這歸因于蛋清位于白煮蛋的外層位置，在貯藏過程中，蛋清凝膠持水性下降，水分逐漸散失，隨后蛋黃中的水分向外遷移，蛋黃水分體積分數(shù)也逐漸降低[17]。相比于冷藏貯藏，室溫下的樣品水分體積分數(shù)下降更為顯著（P＜0.05），這是因為較高的溫度更加有利于水分的蒸發(fā)流失。與溫度相比，去殼處理是導致白煮蛋水分體積分數(shù)損失更重要的原因，與新鮮白煮蛋相比，25 ℃貯藏60 h的去殼白煮蛋蛋清及蛋黃水分體積分數(shù)分別減少了33.8%及11.5%，而相同溫度和時間條件下，帶殼白煮蛋蛋清及蛋黃水分體積分數(shù)分別減少了15.5%及7.1%。實驗結果表明帶殼低溫貯藏可以維持白煮蛋的水分體積分數(shù)，很大程度上減少水分的流失，這對于維持白煮蛋的質量特性和感官品質尤為重要[20]。

2.2 白煮蛋貯藏過程中水分狀態(tài)變化

為了進一步研究白煮蛋中不同形態(tài)水分的變化情況，采用LF-NMR技術獲得樣品弛豫時間T2圖譜。T2b（1～10 ms）代表結合水，主要通過化學作用力結合到蛋白質分子上；T21和T22（10～100 ms）代表不易流動水，是指被束縛在凝膠致密的空間網(wǎng)絡結構內部的水；T23（100～1 000 ms）代表自由水，是在凝膠空間網(wǎng)絡結構外部可以自由移動的水。弛豫峰面積百分數(shù)（A22和A23）可以反映各種狀態(tài)水分的體積分數(shù)[11]：A22代表不易流動水的弛豫峰面積，A23代表自由水的弛豫峰面積。以新鮮白煮蛋為對照組，貯藏60 h的蛋清及蛋黃水分狀態(tài)變化分析如下。

圖2 貯藏60 h白煮蛋蛋清橫向弛豫時間T2變化Fig. 2 Changes in relation time T2 of boiled egg white after storage for 60 h

表1 貯藏60 h白煮蛋蛋清橫向弛豫時間及峰面積Table 1 Relaxation time and peak area of boiled egg white after storage for 60 h

如圖2所示，蛋清的T2弛豫圖譜主要呈現(xiàn)2 個分布峰T22和T23，表明白煮蛋蛋清中水分分布包括不易流動水和自由水，其中T22為主峰，即不易流動水為主要形態(tài)。結合表1結果分析可知，與對照組相比，貯藏60 h后的4 組樣品的T22分布峰均出現(xiàn)左移，T22及A22數(shù)值均顯著變?。≒＜0.05），表明貯藏后白煮蛋蛋清不易流動水體積分數(shù)變小，分析原因可能是蛋清在貯藏過程中，蛋白質發(fā)生氧化導致凝膠結構的作用力發(fā)生變化，特別是蛋白與水的作用，作用力的變化進而引起了白煮蛋吸附水、包裹水等持水能力減弱，最后導致蛋清不易流動水體積分數(shù)減少[21]。對于4 組樣品，不易流動水變化程度依次為4 ℃帶殼＜25 ℃帶殼＜4 ℃去殼＜25 ℃去殼，這與樣品蛋白氧化結果相符。李學鵬等[22]研究蛋白質氧化對肌原纖維蛋白凝膠的影響，得到氧化后蛋白凝膠不易流動水減少、凝膠持水力下降的結論，這與本研究實驗結論相似。同時，貯藏期間4 組樣品自由水的變化情況與不易流動水變化趨勢相似，但其變化程度取決于水分的蒸發(fā)速率，4 ℃帶殼貯藏可以減緩水分的流失速率，減少自由水的損失。

圖3 貯藏60 h白煮蛋蛋黃橫向弛豫時間T2變化Fig. 3 Changes in relation time T2 of boiled egg yolk after storage for 60 h

表2 貯藏60 h白煮蛋蛋黃橫向弛豫時間及峰面積Table 2 Relaxation time and peak area of boiled egg yolk after storage for 60 h

由圖3可知，蛋黃的水分分布情況不同于蛋清，T2弛豫圖譜呈現(xiàn)4 個分布峰，即T2b（1～10 ms）結合水，T21、T22（10～100 ms）不易流動水，T23（100～1 000 ms）自由水；其中弛豫峰面積百分數(shù)（A2b、A21、A22、A23）分別反映各種狀態(tài)水分的體積分數(shù)，A2b代表結合水弛豫峰面積，A21和A22代表不易流動水弛豫峰面積，A23代表自由水弛豫峰面積。結合表2結果分析可知，與對照組相比，貯藏60 h后的4 組樣品的T2b及T23無顯著變化，表明貯藏中蛋黃結合水與自由水無顯著變化。與蛋清變化相似，4 組樣品的T21及T22分布峰均出現(xiàn)左移，T21及T22、A21及A22數(shù)值均變小，表明貯藏后白煮蛋蛋黃的不易流動水體積分數(shù)變小，這可能歸因于兩方面：一方面是貯藏過程中蛋白及脂肪的氧化，破壞原有蛋黃的結構，使得蛋黃不易流動水減少，李銀等[23]研究表明氧化使肉類蛋白凝膠性下降，將不易流動水“態(tài)變”為自由水，導致凝膠持水力降低；另一方面，可能是蛋清水分體積分數(shù)減少，使得蛋黃中的水分向外遷移[17]。

2.3 白煮蛋貯藏過程中氧化程度的變化

蛋白質的側鏈上帶有含—NH或—NH2的氨基酸，對自由基十分敏感，這些基團容易被轉化成羰基基團[15]，因此羰基含量的變化能夠反映蛋白質氧化程度。不同蛋清樣品的羰基含量變化如圖4a所示。不飽和脂肪酸的氧化產物丙二醛與硫代巴比妥酸反應后的產物，可代表脂肪氧化的程度[24]，蛋黃樣品的TBARS含量變化如圖4b所示。

由圖4a可知，隨著貯藏時間的延長，蛋清羰基含量均逐漸增加，表明蛋白質氧化程度隨貯藏時間延長而升高，去殼白煮蛋的羰基含量顯著高于帶殼白煮蛋，表明帶殼有助于延緩蛋白質氧化，這是由于蛋殼的存在可以減少蛋清與空氣中氧的接觸，降低氧化程度；同時低溫對于蛋白質氧化也有明顯的抑制作用，這是因為低溫可以降低氧化反應速率。

圖4 貯藏過程中白煮蛋氧化程度變化Fig. 4 Changes in oxidation degree of boiled eggs during storage

由于脂肪中含有不飽和雙鍵，極易被氧化。從圖4b可知，隨著貯藏時間的延長，4 組蛋黃樣品TBARS含量的變化趨勢與蛋白羰基含量變化趨勢相同，貯藏24 h后，蛋黃的TBARS含量存在顯著性的升高趨勢（P＜0.05），表明在貯藏24 h后蛋黃脂肪發(fā)生氧化并產生低分子產物。對比發(fā)現(xiàn)，去殼白煮蛋的TBARS含量顯著高于帶殼白煮蛋，這表明帶殼有助于延緩脂肪氧化，原因是由于帶殼包裝下的不透氧環(huán)境對氧氣的阻隔性能好，樣品與氧氣的接觸少，脂肪氧化緩慢。王真真[25]采用冰溫氣調包裝減緩了大黃魚貯藏期間的脂肪氧化，對于去殼白煮蛋，增加額外的包裝可以延緩脂肪氧化。

2.4 白煮蛋貯藏過程中質構特性的變化

白煮蛋的硬度和咀嚼性是反映其感官品質的重要指標，一般來講，這兩個指標數(shù)值越大，白煮蛋吃起來就越硬，缺乏彈性，使人們失去食欲。不同貯藏條件下白煮蛋的硬度和咀嚼性結果見圖5。隨貯藏時間的延長，白煮蛋蛋清和蛋黃的硬度及咀嚼性整體均呈上升趨勢，表明貯藏期間白煮蛋感官品質不斷下降，這與葛帥等[26]關于熟雞蛋質構特性的研究結果一致。結果顯示，蛋清的硬度及咀嚼性與其水分體積分數(shù)呈現(xiàn)明顯負相關，即其水分體積分數(shù)越低，這兩個指標數(shù)值越大。分析其原因，在貯藏中隨著蛋白質持水能力降低，水分不斷損失，尤其是不易流動水的減少，使得蛋白之間相互作用增強，形成交叉的連接作用，導致硬度和咀嚼性的增大，感官品質下降[27]。已有研究發(fā)現(xiàn)水分體積分數(shù)是影響肉及紅腸的硬度和咀嚼性變化的重要因素[6]。同時實驗中發(fā)現(xiàn)，貯藏前期帶殼蛋黃（4 ℃）的硬度及咀嚼性出現(xiàn)先減小后增加的變化（圖5b、d），可能原因是低溫能較好地保持蛋黃內部的水分，同時蛋黃內部脂肪逐漸溶出，使得蛋黃逐漸變得松沙，因而測定值在前期降低；但隨著貯藏時間的延長，水分損失增加，加之脂肪氧化導致脂肪含量減少，蛋黃硬度及咀嚼性逐漸增加。對比不同貯藏條件的白煮蛋，冷藏帶殼可有效保持白煮蛋的質構特性，與新鮮白煮蛋相比，貯藏60 h的蛋清及蛋黃硬度分別增加了69.4%和4.1%，咀嚼性分別增加了83.4%和14.9%，在所有樣品中變化幅度最小。余秀芳[28]也研究發(fā)現(xiàn)不同的貯藏條件會影響鹵蛋產品的最終質構特性。

圖5 貯藏過程中白煮蛋硬度和咀嚼性變化Fig. 5 Changes in hardness and chewiness of boiled egg white during storage

2.5 白煮蛋微觀結構的變化

由圖6a所示，新鮮的白煮蛋蛋清凝膠表面有大量的孔洞存在，凝膠微觀結構類似于“蜂窩”狀，表明白煮蛋蛋清三維網(wǎng)絡結構疏松，存在較多的持水空間，這種微觀結構賦予了蛋清適宜的彈性和勁道，口感宜人。圖6b、c顯示，4 ℃貯藏60 h后，帶殼蛋清凝膠網(wǎng)絡結構發(fā)生變化，表面變得略微緊密，但仍存在一定量的孔洞，而4 ℃貯藏60 h的去殼蛋清孔洞減少的更加明顯，凝膠網(wǎng)絡結構較帶殼組更加致密。25 ℃貯藏60 h的帶殼蛋清（圖6d）凝膠微觀結構較4 ℃帶殼蛋清致密，幾乎看不到較大的孔洞，表明常溫貯藏過程中，即使有蛋殼保護，也會改變蛋清凝膠微觀結構，使蛋清持水區(qū)域減少，凝膠持水能力下降；去殼蛋清（圖6e）凝膠網(wǎng)絡結構發(fā)生更大的變化，樣品表面十分致密，幾乎看不出任何孔洞，表面均勻、光滑、平整，持水空間顯著減少，這與LF-NMR測定的不易流動水體積分數(shù)減少相符，這種微觀結構使得蛋清硬度和咀嚼性顯著增加，蛋清變硬，失去適宜口感。

圖6 貯藏60 h白煮蛋蛋清微觀結構（10 000×）Fig. 6 Microstructure of boiled egg white after storage for 60 h (10 000 ×)

2.6 白煮蛋貯藏過程中顏色的變化

由表3可知，新鮮白煮蛋蛋清的L*、a*、b*值分別為87.29、－3.55、9.53，與其對比發(fā)現(xiàn)，4 組樣品在貯藏12 h時，L*、a*、b*值總體無顯著變化，在12 h后，隨著貯藏時間的延長，L*值呈下降趨勢，相反的，a*值和b*值呈上升趨勢，表明白煮蛋蛋清顏色逐漸變暗，向紅黃色方向轉變。對比分析發(fā)現(xiàn)，貯藏溫度對白煮蛋蛋清顏色無顯著影響，但去殼處理使得白煮蛋顏色發(fā)生顯著變化，同一時間下，去殼處理使L*值下降，a*值上升，可能的原因是白煮蛋去殼后，蛋白中賴氨酸在貯藏期間不穩(wěn)定，發(fā)生非酶褐變，引起顏色變化[29]。此外，貯藏過程中蛋清水分體積分數(shù)降低，白煮蛋蛋清凝膠體系中蛋白所占比例發(fā)生變化[19]，進而影響蛋清的色澤。

表3 貯藏過程中白煮蛋顏色變化Table 3 Changes in color parameters of boiled eggs during storage

新鮮白煮蛋蛋黃的L*、a*、b*值分別為81.26、4.34、51.06，在貯藏過程中，4 組樣品蛋黃的L*、a*、b*值均呈下降的趨勢，表明隨貯藏時間的延長，蛋黃顏色逐漸變暗，黃色逐漸變淺。劉麗莉等[21]在研究鹵蛋蛋黃顏色變化時發(fā)現(xiàn)相似的變化趨勢。這是因為蛋黃中含有較多的水溶性玉米黃色素，在貯藏過程中色素溶解，隨水分的流失而減少，導致b*值下降，同時脂肪氧化也會影響蛋黃顏色的變化。陳景宜[30]發(fā)現(xiàn)，肉制品加工貯藏過程中，會促進內部脂肪發(fā)生氧化，導致其褪色或變色，從而使L*、a*值變化。這與本研究的結果一致。

3 結 論

白煮蛋在不同的貯藏條件下品質均發(fā)生了變化，表現(xiàn)為硬度和咀嚼性增加，蛋清顏色變暗變黃，蛋黃黃色消減，其中25 ℃去殼組品質變化最顯著，而4 ℃帶殼組變化最小。白煮蛋貯藏過程中品質的劣變與其水分體積分數(shù)，尤其是不易流動水體積分數(shù)的減少相關，同時也受到蛋白及脂肪氧化的影響，后續(xù)實驗將深入討論以上指標的相關性問題，如建立表觀品質與水分分布及氧化指標之間的相關性模型。因此，以此為理論依據(jù)，延長白煮蛋的保質期應考慮維持其合理的水分分布及控制氧化的發(fā)生，推測添加天然食品抗氧化劑及螯合劑、采用真空包裝、氣調包裝等技術是延長白煮蛋保質期的有效方法。

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