胡泠影 張圓圓 曾峰 華清泉

內(nèi)耳細胞的過氧化損傷與多類神經(jīng)性聾有關(guān)[1，2]。研究表明血管紋邊緣細胞(marginal strial cell，MC)很容易受到過氧化損害，MC在維持耳蝸內(nèi)高鉀狀態(tài)、淋巴高滲透壓、耳蝸內(nèi)高電位等特殊電生理特征方面有重要意義，是維持耳蝸毛細胞生理功能的必要條件[3，4]。過氧化損傷通常由活性氧(reactive oxygen species，ROS)引起，細胞內(nèi)ROS增多時，會引起細胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的過氧化損傷，破壞細胞的結(jié)構(gòu)和功能，引發(fā)細胞凋亡、壞死或組織功能的損害[5，6]。目前氧化應(yīng)激模型多采用葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GO)法，GO可模擬氧化環(huán)境，使細胞穩(wěn)定產(chǎn)生H2O2[7～9]。國內(nèi)外已經(jīng)建立了體外培育MC的一系列方法，本研究擬采用GO處理體外培育的MC來建立大鼠耳蝸MC的過氧化損傷模型，并評價該模型的穩(wěn)定性和可靠性，為進一步探究MC氧化損傷的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1大鼠耳蝸MC的提取及培養(yǎng) 取3日齡以內(nèi)的SD幼鼠(42只，每次用4～8只，分7次完成，分別用于以下實驗)耳蝸，用75%酒精浸泡10分鐘后，去除幼鼠雙側(cè)顳骨，在顯微鏡下從耳蝸頂部至底部逐層解剖分離得到血管紋細胞。將所得組織剪碎至約0.5 mm后用II型膠原酶在37 ℃恒溫箱中消化30分鐘，隨后800～1 000 rpm離心機離心5分鐘；去除上清液，將細胞轉(zhuǎn)移至上皮細胞培養(yǎng)基中(EpiCM，Scien Cell, USA)置于5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用[10]。

1.2大鼠MC的鑒定 提取培養(yǎng)的MC用角蛋白-18(CK18)作為標記物通過免疫熒光法進行細胞鑒定[10]。將所提取的MC接種至多聚賴氨酸(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,USA)處理過的蓋玻片上，置于12孔細胞培養(yǎng)板中制作細胞爬片，待MC爬片形成單層細胞結(jié)構(gòu)后，棄掉培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后，用4%的多聚甲醛在室溫下固定15分鐘，隨后再用PBS清洗3次；用0.3% TritonX-100(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,USA)將MC破膜處理20分鐘，然后用PBS清洗三次；5%的血清白蛋白(BSA)封閉20分鐘后，用CK18抗體(1∶50，Abcam，Cambridge, MA, USA)在4 ℃下孵育過夜，隨后用抗兔的IgG二抗(1∶100)在室溫下孵育30分鐘，然后用PBS清洗三次。洗滌MC并用4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma-Aldrich，St. Louis, MO,USA)在室溫下染色3分鐘后，在熒光顯微鏡下觀察并鑒定。

1.3CCK8法檢測GO對MC損傷的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)值 用CCK8法(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)檢測細胞活性，以獲得GO對MC損傷的IC50值。將MC接種于96孔板中，待細胞形成單層結(jié)構(gòu)而且細胞融合度約為90%時，每孔加入0、1、2、4、8、16、32、64 mU/ml的GO，每個濃度制作3個復(fù)孔，處理24小時；隨后每孔加入20 μl的CCK8工作液，37 ℃孵育1.5小時后，450 nm下酶標儀檢測每孔的吸光度值(OD值)。以不含細胞的孔為調(diào)零組，GO濃度為0 mU/ml的孔為空白組，其余組為濃度梯度組，各組細胞活性%=(各濃度梯度組OD值-調(diào)零組OD值)/(空白組OD值-調(diào)零組OD值)×100%，制作GO對MC凋亡作用的濃度依賴曲線，據(jù)此得出GO對MC損傷的IC50值。

1.4流式細胞術(shù)及熒光顯微鏡檢測原代MC內(nèi)ROS的表達 細胞內(nèi)活性氧的水平用熒光分子探針DCFH-DA(Beyotime, Shanghai, China)檢測，將MC接種于6孔板內(nèi)，分為以下兩組：用GO處理的MC作為實驗組，處理時間為24小時，GO濃度采用1.3中所測算的IC50值；以不加GO處理的MC作為對照組，處理時間同實驗組；然后，用DCFH-DA(10 μM)室溫下孵育30分鐘后，用流式細胞術(shù)和熒光顯微鏡檢測兩組ROS的表達。

1.5超氧化化物歧化酶(SOD)活性的檢測 實驗組及對照組細胞產(chǎn)生的超氧化物歧化酶活性通過WST試劑盒檢測(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,USA)，高水溶性的四唑鹽WST-1被樣品中的O2-氧化生成甲臜，其濃度與SOD活性成正比，然后用酶標儀在450 nm波長下檢測樣品吸光度。SOD標準樣品的濃度范圍是0.001～200 Units/ml，樣品的蛋白濃度用BCA法測定，單位為mg/ml，SOD的相對活性的單位為Units/mg。

1.6Western-blot檢測MC的凋亡蛋白 提取原代MC之后，將其均勻接種至6孔板中(細胞數(shù)量3.0×105個/孔)，實驗組及對照組MC分別處理24小時后，每孔加入含有1 mM的phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)RIPA裂解液100 μl，在4 ℃下處理30分鐘，BCA法測定聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶-1(PARP1)和凋亡蛋白cleaved-caspase 3的蛋白濃度。用12%的SDS-page緩沖液電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜，用抗PARP1，cleaved-caspase-3，β-actin (Cell Signaling Technology, MA, USA)等抗體4 ℃下孵育過夜?；瘜W(xué)偶聯(lián)二抗室溫下孵育1小時后檢查印記的發(fā)光值，用Image Lab軟件分析灰度值，用β-actin灰度值(DPI)作為基準量。

1.7流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 用Annexin V-FITC和propidium iodide (PI)雙標進行細胞凋亡的檢測。實驗組和對照組分別處理24小時之后，用PBS清洗3次，胰蛋白酶消化至約80%的細胞發(fā)生皺縮后終止消化，離心機1 000 rpm離心5分鐘后棄掉懸液，用PBS清洗2次，用包含有5 μlAnnexin V-FITC和5μlPI的100 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸MC，室溫避光孵育15分鐘，隨后用流式細胞儀檢測(BD Biosciences, Carlsbad, CA)細胞凋亡情況。

1.8熒光試劑盒檢測MC凋亡 用熒光試劑盒Hoechst/PI檢測GO處理后細胞的凋亡。將MC接種于多聚賴氨酸預(yù)處理過的12孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞分散形成單層結(jié)構(gòu)后，加入Hoechst33258溶液，使其終濃度為1 mg/ml，在37 ℃下處理7分鐘。PBS清洗后，加入PI染液，使其終濃度為5 mg/ml,冰浴處理，PBS清洗之后，將培養(yǎng)板置于倒置熒光顯微鏡下(LSCM)觀察，記錄400～500 nm下的藍光和紅光，其中藍光標記Hoechst，紅光標記PI。用Corel Draw X5(Corel, Canada)軟件獲取圖像。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0 (IBM, USA)統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，Western-blot結(jié)果采用Image Lab軟件(NIH，USA)進行分析，實驗組與對照組的對比采用獨立樣本t檢驗或卡方檢驗。

2 結(jié)果

2.1原代MC的培養(yǎng)與鑒定 大鼠MC呈多邊形，有明顯的邊界,細胞之間緊密連接形成單層鋪路石樣結(jié)構(gòu)，免疫熒光中CK8染色為強陽性(圖1)。

2.2GO對MC活性的影響 用梯度濃度的GO處理MC 24小時后，MC出現(xiàn)不同比例的凋亡，GO對MC損傷的濃度依賴曲線見圖2，算得IC50=32.9 mU/ml [18.93，57.24]。

2.3實驗組MC中ROS和SOD濃度 流式細胞學(xué)及免疫熒光檢測結(jié)果提示，實驗組MC內(nèi)ROS產(chǎn)生量較對照組顯著增多(P=0.021 8)；WST法檢測結(jié)果顯示，實驗組SOD活性顯著下降(P=0.002 7)(圖2、表1)。

2.4原代MC中凋亡相關(guān)蛋白的表達 Western-blot檢測結(jié)果提示，實驗組中凋亡蛋白cleaved-caspase-3以及聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶-1(PARP1)的表達升高(圖3、表1)。

2.5GO對MC凋亡的誘導(dǎo) 實驗組細胞凋亡率較對照組增高(P=0.000 7)(圖3、表1)。Hoechst染色結(jié)果顯示GO處理后MC核發(fā)生皺縮、碎裂，PI染色結(jié)果示實驗組細胞凋亡率更高(P=0.021 8)(圖4)。

3 討論

氧化應(yīng)激反映細胞內(nèi)ROS生成和清除的不平衡狀態(tài)，是許多疾病中細胞損傷的病理生理基礎(chǔ)[11～13]。內(nèi)耳MC中的線粒體和過氧化物酶體系均可產(chǎn)生ROS，其中線粒體是主要產(chǎn)生部位[14,15]，同時，細胞通過小分子抗氧化物質(zhì)、抗氧化酶和具有抗氧化作用的代謝酶組成的抗氧化系統(tǒng)維持細胞內(nèi)氧化還原的平衡狀態(tài)。病理情況下，ROS過量產(chǎn)生，超過細胞自身的抗氧化系統(tǒng)清除能力時，便會出現(xiàn)細胞受損甚至凋亡，引起其功能損害[16，17]。SOD作為細胞內(nèi)氧自由基清除劑,對氧化應(yīng)激引起的內(nèi)耳毛細胞及聽覺神經(jīng)元損傷具有保護作用，病理狀況下SOD的活性可被抑制。20世紀80年代以來，許多學(xué)者已經(jīng)先后報道了耳蝸MC在老年性聾、藥物性聾、噪聲性聾中的氧化損傷機制。耳蝸細胞的代謝非常旺盛，可產(chǎn)生大量ROS，生理情況下，ROS被耳蝸自身的抗氧化酶系統(tǒng)清除；病理狀態(tài)下，ROS的清除速率下降，會對耳蝸尤其是MC產(chǎn)生功能性的損傷，導(dǎo)致耳蝸內(nèi)環(huán)境紊亂，誘發(fā)各種類型的神經(jīng)性聾[18～21]。因此建立穩(wěn)定可靠的耳蝸MC氧化應(yīng)激損傷模型對于進一步探究其分子機制的意義重大。

表1 實驗組和對照組凋亡相關(guān)指標ROS、SOD含量對比±s)

GO在基礎(chǔ)實驗中主要用來模擬過氧化環(huán)境，GO與過氧化氫酶組成一個氧化還原酶系統(tǒng)，能夠氧化β-D-葡萄糖生成H2O2和D-葡萄糖酸內(nèi)酯。H2O2屬活性氧，生理狀態(tài)下它能夠促進細胞的代謝和增殖；但是過多的H2O2會導(dǎo)致包膜脂質(zhì)體過氧化、線粒體損傷、DNA損傷，促進細胞凋亡[22，23]。本研究中先采用不同濃度的GO處理MC 24小時后，發(fā)現(xiàn)隨著GO濃度升高，MC活性逐漸降低，凋亡率逐漸升高，由此測得GO對MC損傷的IC50值為32.9 mU/ml，與最近發(fā)表文獻結(jié)果[24,25]相近。采用IC50值濃度(32 mU/ml)的GO作為供氧劑處理MC24小時以后，ROS和SOD檢測結(jié)果顯示，實驗組MC中ROS生成增多、SOD活性下降，細胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)失衡，說明本研究成功建立了MC的過氧化應(yīng)激模型。

對過氧化損傷致神經(jīng)性聾機制的研究一定程度上依賴可靠的動物模型。本研究在用GO誘導(dǎo)大鼠MC氧化應(yīng)激后，結(jié)合常用的一些凋亡相關(guān)評價指標對所建模型的可靠性進行了評價，可見，Western-blot檢測結(jié)果顯示實驗組MC中cleaved-caspase-3表達量增高，與國內(nèi)的一些研究結(jié)果[26]相同。聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶-1(PARP1)表達升高與細胞內(nèi)凋亡的發(fā)生相關(guān)[27]，本研究中實驗組PARP1表達較對照組明顯升高；本研究采用Annexin V-FITC和propidium iodide (PI)法對比兩組細胞的凋亡水平，結(jié)果顯示實驗組細胞凋亡率高于對照組，說明32 mU/ml的GO顯著地促進了MC的凋亡，與最新研究結(jié)果相近[26]。此外，Hoechst/PI染色也是常用的細胞凋亡檢測方法，Hoechst染料進入包膜通透性發(fā)生改變的凋亡細胞內(nèi)與DNA結(jié)合并染色，本研究結(jié)果顯示實驗組的細胞核發(fā)生皺縮、碎裂，說明細胞發(fā)生了凋亡。以上這些結(jié)果均說明，IC50濃度的GO處理的MC確實發(fā)生了明顯的氧化應(yīng)激，并導(dǎo)致細胞凋亡，驗證了該模型的可靠性和穩(wěn)定性。

綜上所述，本研究采用GO作用于體外培養(yǎng)MC的方法成功建立了穩(wěn)定可靠的大鼠耳蝸MC的氧化應(yīng)激損傷模型，為今后進一步深入研究MC過氧化損傷的分子機制及臨床治療奠定了基礎(chǔ)。

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