丁思思 黃莉莉 梁含思 張 允 曹 磊 張學(xué)光

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院江蘇省臨床免疫研究所，江蘇省胃腸道腫瘤免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州 215007)

胃癌發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤第三、第四位，是全球最常見(jiàn)的高危害惡性腫瘤之一[1]。在對(duì)其發(fā)展機(jī)制的長(zhǎng)期研究中，人們發(fā)現(xiàn)機(jī)體免疫系統(tǒng)可影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究證實(shí)，多種細(xì)胞因子和免疫卡控點(diǎn)分子的表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移相關(guān)，改變這些免疫分子的表達(dá)水平可以影響胃癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸[2]。

PD-L1( Programmed cell death-Ligand 1)是負(fù)性共刺激分子B7家族成員之一。近年來(lái)，隨著腫瘤免疫治療的興起，PD-L1越來(lái)越引起人們的重視。人 PD-L1基因位于人染色體9p24，mRNA可表達(dá)于正常人和小鼠包括心、肝、脾、 腎等多種組織[3,4]。蛋白水平上，PD-L1在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和培養(yǎng)的骨髓來(lái)源的肥大細(xì)胞上也均有表達(dá)[5-10]。研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1分子異常表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面，包括胃癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等[11-16]。

腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD-L1分子通過(guò)與浸潤(rùn)的T細(xì)胞表面的PD-1受體結(jié)合可以誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡或無(wú)能，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。PD-L1分子在腫瘤組織浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞及其亞群上表達(dá)可影響腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞與浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞之間的相互作用，且其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)程度與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及患者預(yù)后密切相關(guān)[17]。腫瘤細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)此類負(fù)性分子受體的表達(dá)逃避細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)的殺傷作用，減弱機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答。而特異性阻斷PD-1/PD-L1抑制信號(hào)可上調(diào)IFN-γ、IL-2、IL-10的分泌，有效促進(jìn)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的活化增殖[18]，使機(jī)體中失能的效應(yīng)性免疫細(xì)胞恢復(fù)生物學(xué)功能，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別及殺傷能力，從而提高機(jī)體清除腫瘤的能力[18]。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-L1在胃癌患者術(shù)前術(shù)后外周血T細(xì)胞和單核細(xì)胞上的表達(dá)變化規(guī)律，發(fā)掘其作為可能生物標(biāo)志物的價(jià)值，為胃癌的預(yù)警和免疫干預(yù)提供有效的靶點(diǎn)，也將為免疫治療開(kāi)拓新途徑。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 收集2015年1月～2016年12月在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的胃腺癌原發(fā)病例44例(男24例，女20例)，平均年齡為(58.6±13.2)歲。臨床分期為：T1、T2期14例，T3、T4期30例；N0 16例，N1 6例，N2 11例，N3 11例；M0 44例，M1 0例。所有患者均為手術(shù)住院治療的原發(fā)性胃癌，均經(jīng)病理組織學(xué)確診，采血前均未接受手術(shù)、放療及化療等抗腫瘤治療，并在所有患者術(shù)后4～7 d 內(nèi)進(jìn)行復(fù)查和隨訪。所有胃癌患者均排除心腎功能異常，基礎(chǔ)代謝性疾病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕等免疫性疾病，且在術(shù)中或術(shù)后無(wú)嚴(yán)重并發(fā)癥。同時(shí)選取性別和年齡匹配的健康人血液標(biāo)本18例(男11 例，女7例)，平均年齡(50.4±10.6)歲作為健康對(duì)照組。本研究經(jīng)過(guò)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.1.2試劑和儀器 鼠抗人PD-L1-PE熒光素標(biāo)記單克隆抗體(Biolegend公司，美國(guó))；鼠抗人CD3-FITC、CD4-PE-CY5、CD8-PE-CY7、CD14-FITC熒光素標(biāo)記單克隆抗體(Miltenyi biotec公司，德國(guó))；PE標(biāo)記的小鼠IgG作為同型對(duì)照(Beckman Couher公司，美國(guó))；紅細(xì)胞裂解液(Beckman Coulter公司，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(Coulter Epics XL flow cytometer，Beckman Coulter公司，美國(guó))。

1.2方法

1.2.1胃癌患者血液標(biāo)本的收集 分別在術(shù)前24 h 內(nèi)和術(shù)后第3天，于清晨6：00，用EDTA抗凝管采集受試胃癌患者和健康志愿者空腹靜脈血2 ml備用。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子 全血細(xì)胞按50 μl/test，并依次分別加入以下抗體：①空白對(duì)照；②CD3(FITC)3 μl；③CD4(PE)1 μl；④CD4(PC5)1 μl；⑤CD8(PC7)1 μl；⑥CD3(FITC)3 μl+CD4(PC5)1 μl +CD8(PC7)1 μl；⑦CD3(FITC)3 μl+CD4(PC5)1 μl +CD8(PC7)1 μl +PD-L1(PE)1 μl；⑧CD14(FITC)3 μl；⑨CD14(FITC) 3 μl +PD-L1(PE)1 μl，4℃避光反應(yīng)20～30 min。每管加入紅細(xì)胞裂解液300 μl，充分振蕩后置于40℃水浴鍋5 min，加2 ml PBS終止反應(yīng)，1 200 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS 500 μl成細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各指標(biāo)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1胃癌患者外周血T細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)水平無(wú)顯著變化 流式細(xì)胞術(shù)選取外周血CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞，檢測(cè)其表面PD-L1的表達(dá)(圖1)。結(jié)果顯示，胃癌患者CD3+CD4+T細(xì)胞的PD-L1表達(dá)為(11.1±6.4)%，而健康對(duì)照組則為(9.8±5.6)%，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.453 2)，如圖2A所示。胃癌患者CD3+CD8+T細(xì)胞的PD-L1表達(dá)為(13.9±12.0)%，而健康對(duì)照組為(12.0±7.1)%，兩者差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.558 9)，如圖2B所示。

2.2胃癌患者外周血CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)水平顯著增加 流式細(xì)胞術(shù)選取外周血CD14+單核細(xì)胞，檢測(cè)其表面PD-L1的表達(dá)(圖3)。結(jié)果顯示，胃癌患者外周血CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組[(29.2±16.7)% vs (17.5±9.7)%，P=0.007 3]，如圖4所示。

2.3胃癌患者手術(shù)后外周血T細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平顯著增加 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌患者手術(shù)前后外周血T細(xì)胞PD-L1的表達(dá)，結(jié)果顯示，與手術(shù)前相比，44例胃癌患者術(shù)后CD3+CD4+T細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)顯著高于術(shù)前水平[(15.8±8.2)% vs(11.1±6.4)%，P=0.001 5](圖5A)；與此結(jié)果相類似，術(shù)后CD3+CD8+T細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)也顯著高于術(shù)前水平[(22.5±13.3)% vs(13.9±12.0)%，P=0.000 2](圖5B)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)的流程圖Fig.1 Expression of PD-L1 on CD3+CD4+T cells and CD3+CD8+T cells was detected by flow cytometry

圖2 胃癌患者CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)Fig.2 Expression of PD-L1 on CD3+CD4+T cells and CD3+CD8+T cells in patients with gastric cancer

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD14+單核表面PD-L1表達(dá)的流程圖Fig.3 Detection of PD-L1 expression on CD14+ monocytes by flow cytometry

2.4胃癌患者手術(shù)后外周血CD14+單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平與術(shù)前相比無(wú)顯著變化 進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)，結(jié)果顯示，在CD14+單核細(xì)胞中，術(shù)后CD14+細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)水平與手術(shù)前相比無(wú)顯著變化[(33.8±17.3)% vs(29.2±16.7)%，P=0.082 8](圖6)。

2.5胃癌患者手術(shù)后外周血T細(xì)胞PD-1表達(dá)水平無(wú)顯著變化 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌患者手術(shù)前后外周血T細(xì)胞PD-1的表達(dá)，結(jié)果顯示，與手術(shù)前相比，44例胃癌患者術(shù)后CD3+CD4+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[(25.6±9.9)% vs(26.9±8.9)%，P=0.505 5](圖7A)； 與此結(jié)果相類似，術(shù)后CD3+CD8+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)與術(shù)前相比也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[(26.5±14.6)% vs(29.9±10.4)%，P=0.1187](圖7B)。

圖4 胃癌患者CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)Fig.4 Expression of PD-L1 on CD14+ monocytes in patients with gastric cancer

圖5 胃癌患者術(shù)前術(shù)后CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)Fig.5 Expression of PD-L1 on CD3+CD4+T cells and CD3+CD8+T cells in patients with gastric cancer before and after surgery

圖6 胃癌患者術(shù)前術(shù)后CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)Fig.6 Expression of PD-L1 on CD14+ monocytes in patients with gastric cancer before and after surgery

圖7 胃癌患者術(shù)前術(shù)后CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)Fig.7 Expression of PD-1 on CD3+CD4+T cells and CD3+CD8+T cells in patients with gastric cancer before and after surgery

3 討論

胃癌的發(fā)病率高，疾病相關(guān)死亡率高，晚期胃癌患者的中位總生存期僅12 個(gè)月，且臨床治療手段有限[19]。免疫卡控點(diǎn)分子在細(xì)胞免疫應(yīng)答過(guò)程中起到負(fù)性調(diào)控作用，正常情況下參與維持機(jī)體免疫耐受、防止組織免疫損傷等過(guò)程，并在腫瘤發(fā)生過(guò)程中與免疫逃逸密切相關(guān)[20]。PD-L1作為一種負(fù)性共刺激分子，以膜型和可溶型兩種形式存在，構(gòu)成精確的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，參與免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、抗原信息傳遞以及免疫應(yīng)答的適時(shí)中止?？扇苄訮D-L1可由樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞及活化的T 細(xì)胞分泌，存在于正常人的外周血[21]，而腫瘤患者的腫瘤細(xì)胞也可分泌可溶性的負(fù)性共刺激分子到外周血中。有文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤患者外周血血漿的可溶性PD-L1表達(dá)顯著高于正常人[22,23]。此外，正常外周血的單核細(xì)胞、激活的T 細(xì)胞均表達(dá)多種負(fù)性共刺激分子如PD-L1、B7-H3和B7-H4等，可能在應(yīng)激、炎癥的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，同時(shí)負(fù)性共刺激分子表達(dá)受到腫瘤組織微環(huán)境相關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)控。

多項(xiàng)研究表明，PD-L1在正常胃組織中幾乎不表達(dá)，而在胃癌組織中表達(dá)陽(yáng)性率可達(dá)40%～50%[24-26]，目前有關(guān)胃癌PD-L1的研究主要集中在腫瘤組織中，而其在胃癌患者外周血T細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)水平的相關(guān)研究甚少，鑒于目前實(shí)體腫瘤的PD-L1表達(dá)與外周血細(xì)胞的PD-L1表達(dá)之間的關(guān)系尚不清楚，本研究中我們檢測(cè)了44例胃癌患者和18例健康人外周血T細(xì)胞和單核細(xì)胞上的PD-L1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌組CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組。那么腫瘤患者外周血中高表達(dá)PD-L1的CD14+細(xì)胞是怎么產(chǎn)生的呢？會(huì)不會(huì)是腫瘤組織中浸潤(rùn)的單核-巨噬細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，又或是機(jī)體針對(duì)腫瘤組織產(chǎn)生全身的免疫反應(yīng)從而使得外周血單核細(xì)胞的PD-L1表達(dá)增加？這些問(wèn)題都有待進(jìn)一步研究解決。另一方面，血液中單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)增加能不能作為潛在的腫瘤篩選標(biāo)志？這也是我們關(guān)心的問(wèn)題，接下來(lái)我們將進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行系統(tǒng)的分析。而對(duì)44例胃癌患者術(shù)前術(shù)后外周血單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)的分析結(jié)果顯示，術(shù)前術(shù)后單核細(xì)胞的PD-L1表達(dá)百分比沒(méi)有明顯改變，這提示我們，外周血單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)增加更有可能是全身的免疫反應(yīng)而不太可能是腫瘤組織的CD14+細(xì)胞脫落而來(lái)。

本研究同時(shí)檢測(cè)了外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)，結(jié)果顯示，胃癌患者T細(xì)胞的PD-L1表達(dá)水平較健康人無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這提示外周血T細(xì)胞的PD-L1表達(dá)與胃癌之間可能并沒(méi)有直接的聯(lián)系，而單核細(xì)胞的PD-L1表達(dá)則更可能與腫瘤相關(guān)。有趣的是，與術(shù)前相比，術(shù)后無(wú)論是CD4+T細(xì)胞還是CD8+T細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)均顯著上調(diào)，之所以造成這種情況，一方面可能是手術(shù)創(chuàng)傷引起的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致了T細(xì)胞PD-L1的上調(diào)；另一方面，隨著腫瘤的切除，PD-L1在應(yīng)激的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，持續(xù)激活PD-1通路可抑制腫瘤抗原特異性T細(xì)胞活化，削弱T細(xì)胞抗腫瘤活性，從而出現(xiàn)了應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致PD-L1上調(diào)。此外，T細(xì)胞上PD-1的術(shù)前術(shù)后檢測(cè)結(jié)果并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示術(shù)后T細(xì)胞的抑制功能并沒(méi)有發(fā)生改變，這個(gè)結(jié)果也提示我們，在應(yīng)激作用下PD-L1在T細(xì)胞上表達(dá)的功能有可能并不依賴于PD-1的表達(dá)。

總而言之，外周血單核細(xì)胞的PD-L1可能與胃癌的發(fā)生以及腫瘤免疫的狀態(tài)有關(guān)，對(duì)該指標(biāo)的檢測(cè)有助于胃癌的初步篩查。此外，外周血T細(xì)胞的PD-L1與患者的創(chuàng)傷和全身免疫狀態(tài)有關(guān)，但對(duì)胃癌的發(fā)生和腫瘤免疫的作用還有待進(jìn)一步研究。

以PD-1/PD-L1抑制劑為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑，在多期臨床試驗(yàn)中成效顯著，為腫瘤生物治療帶來(lái)新的機(jī)遇。至2016年12月31日，已有2種PD-1抗體(Nivolumab和Pembrolizumab) ，1種PD-L1抗體(Atezulizumab) 通過(guò)FDA 批準(zhǔn)正式進(jìn)入臨床應(yīng)用。通過(guò)監(jiān)測(cè)胃癌患者外周血細(xì)胞PD-L1的表達(dá)水平，為進(jìn)一步發(fā)掘PD-L1分子作為腫瘤分子靶標(biāo)提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也對(duì)評(píng)價(jià)胃癌治療效果、疾病進(jìn)展及預(yù)后具有重要價(jià)值。

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