胡雪嬌 楊佳 程燦 周繼華 牛付安 王新其 張美良 曹黎明,* 儲(chǔ)黃偉,*

農(nóng)作物的馴化是一個(gè)野生植物品種不斷變異加上人工選擇的過程[1]。到了近代，人們利用物理、化學(xué)等手段誘導(dǎo)農(nóng)作物的遺傳物質(zhì)發(fā)生變異，再從誘變?nèi)后w中選擇符合人們某種要求的突變個(gè)體，進(jìn)而培育成新的品種。在過去幾十年里，用這種誘變育種方法獲得了大量有價(jià)值的種質(zhì)資源[2]。然而，誘變育種存在著變異的位點(diǎn)隨機(jī)，有益突變頻率較低以及變異方向和性質(zhì)難以控制等問題。隨著功能基因組學(xué)以及基因編輯技術(shù)的發(fā)展，使得定向編輯特定靶基因，從而快速獲得具有預(yù)期性狀的農(nóng)作物新品種這一目標(biāo)成為可能。CRISPR/Cas9是2013年開始發(fā)展起來的一種基因編輯技術(shù)[3-6]，與鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonucleases,ZFNs)[7]和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activatorlike effector nucleases,TALENs)[8]等基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)由于設(shè)計(jì)使用簡單、靈活，費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn)，成為最受關(guān)注、使用最為廣泛的基因編輯技術(shù)[9]。利用CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)在水稻[10-12]、玉米[13]、小麥[11,14]、高粱[12]、大豆[15-17]、番茄[18]等作物中實(shí)現(xiàn)了基因定點(diǎn)編輯。最近的研究發(fā)現(xiàn)使用CRISPR/Cas9技術(shù)在轉(zhuǎn)基因水稻的T0代植株中，就可以獲得純合的靶基因突變植株，并且編輯后的基因可以穩(wěn)定遺傳到下一代[19]。

水稻SD1基因，被譽(yù)為“綠色革命基因”，編碼赤霉素合成途徑中一個(gè)關(guān)鍵的酶——赤霉素20-氧化酶，功能缺失突變的等位基因sd1會(huì)使得水稻植株獲得半矮稈的表型，并顯著提高產(chǎn)量[20-22]。我國水稻矮稈育種中普遍利用的秈稻矮源矮仔占、矮腳南特和低腳烏尖等品種,其矮生性均由sd1控制[23]。例如，低腳烏尖的SD1基因發(fā)生了382 bp的缺失[20]。20世紀(jì)50年代至60年代初開始的矮稈育種主要是在秈稻品種中進(jìn)行的，中國選育的代表性矮稈品種矮腳南特和矮仔占，以及隨后菲律賓、韓國和美國等國相繼育成的IR8、統(tǒng)一和Calrose 76等矮稈高產(chǎn)品種都是秈稻品種[23]。Asano等[24]通過比較半矮稈的粳稻日本晴和高稈的秈稻Kasalath發(fā)現(xiàn)，日本晴的SD1基因中存在兩個(gè)SNP位點(diǎn)，導(dǎo)致SD1編碼的赤霉素20-氧化酶在第100和340位的兩個(gè)氨基酸分別為谷氨酸和谷氨酰胺，而Kasalath的SD1蛋白在第100和340位氨基酸分別是甘氨酸和精氨酸，并且這兩個(gè)功能性的SNP位點(diǎn)在所有粳稻品種中都存在，而幾乎所有的秈稻地方品種和野生稻的SD1序列都與Kasalath的SD1一致。因此，人類在馴化粳稻品種的過程中，已經(jīng)將突變的矮稈基因sd1篩選并固定下來。

上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院在利用“秈粳架橋”技術(shù)[25]創(chuàng)制恢復(fù)系的過程中，獲得一些各方面性狀優(yōu)良，但株型偏高的恢復(fù)系。申繁17和申繁24從以粳稻恢復(fù)系ZR213為母本、CR-3為父本的重組自交系后代中選育而來。ZR213、CR-3以及申繁17和申繁24的株高都相對(duì)偏高。本研究以申繁17和申繁24為材料，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)品種的SD1基因序列和秈稻的SD1等位基因一致，用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)這兩個(gè)品種的SD1基因進(jìn)行基因編輯，以期快速獲得不含轉(zhuǎn)基因序列的矮稈恢復(fù)系材料。

1 材料與方法

1.1 植物材料、載體和菌株

轉(zhuǎn)基因受體材料為上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所選育的粳稻恢復(fù)系申繁17和申繁24。本研究所用的CRISPR/Cas9中間載體psgR-Cas9-Os由中國科學(xué)院上海植物逆境生物學(xué)研究中心朱健康教授提供[10]。大腸桿菌Top10、農(nóng)桿菌EHA105和pCAMBIA1300載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶BbsⅠ、T4 DNA連接酶購自NEB公司；Taq酶、氨芐青霉素、卡那霉素、LB培養(yǎng)基等其他試劑購自上海生工生物工程有限公司。

1.3 引物

本研究所用的引物序列見表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 申繁17和申繁24的SD1基因型檢測(cè)

以申繁17和申繁24的基因組DNA為模板，以引物EXON1-F和EXON1-R擴(kuò)增SD1第1外顯子，以引物EXON3-F和EXON3-R擴(kuò)增SD1第3外顯子，然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與日本晴和Kasalath的SD1序列進(jìn)行比對(duì)。

1.5 CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)選擇

使用 CRISPR Primer Designer軟件[25]進(jìn)行CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)選擇。然后通過水稻基因組BLAST分析，確保靶位點(diǎn)的特異性。

1.6 CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)靶位點(diǎn)的序列，合成兩條引物Oligo-F和Oligo-R，每條引物(10μmol/L)各取1μL，加入8μL退火緩沖液(TE+50 mmol/L NaCl），以0.1℃/s的速率從95℃降到16℃，獲得靶位點(diǎn)接頭。中間載體psgR-Cas9-Os用BbsⅠ酶切，回收載體片段，然后以1∶3的摩爾數(shù)比與靶位點(diǎn)接頭混合，用T4連接酶鏈接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，用引物為M13-F和Oligo-R進(jìn)行菌落PCR鑒定，并測(cè)序驗(yàn)證。獲得的中間載體psgR-Cas9-Os-SD1用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后，回收大約5.6 kb長的片段，并用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切載體pCAMBIA1300，回收載體片段，將回收的片段與載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，同樣用引物M13-F和Oligo-R進(jìn)行菌落PCR鑒定，并測(cè)序驗(yàn)證，獲得雙元載體CRISPR-SD1。

表1 本研究所用的引物Table 1.Primers used in this research.

1.7 陽性轉(zhuǎn)基因植株的獲得及驗(yàn)證

獲得的載體CRISPR-SD1用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化申繁17和申繁24的愈傷組織，用潮霉素篩選獲得T0代植株。取葉片提取基因組DNA，用CRISPR-SD1載體特異性引物M13-F和Oligo-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為253 bp，能擴(kuò)增出目的片段的植株為轉(zhuǎn)基因陽性植株。

1.8 靶位點(diǎn)序列的檢測(cè)

取葉片提取基因組DNA，以引物SEQ1-F和SEQ1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10。隨機(jī)挑取10個(gè)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與野生型的SD1基因編碼區(qū)序列比對(duì)，如果10個(gè)克隆的序列全部是突變的，則為純合突變體，如果10個(gè)克隆的序列既有突變的，也有野生型的，則為雜合子。

2 結(jié)果與分析

2.1 申繁17和申繁24的SD1基因序列的分析及靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

為了分析ZR213、CR-3、申繁17和申繁24中SD1基因的基因型，對(duì)其SD1基因的第1和第3外顯子進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)ZR213、CR-3、申繁17和申繁24中SD1基因型與秈稻Kasalath的SD1等位基因型是一致的(圖1)。表明在“秈粳架橋”創(chuàng)制恢復(fù)系的過程中，將秈稻的SD1等位基因?qū)氲搅松攴?7和申繁24中，導(dǎo)致這兩個(gè)品種株高過高。

為了構(gòu)建編輯SD1基因的CRISPR/Cas9表達(dá)載體，將SD1基因cDNA序列輸入CRISPR Primer Designer軟件，找到了7個(gè)CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)(表2)，用BLAST分析這些靶位點(diǎn)序列在水稻基因組中的特異性，最后選用靶位點(diǎn)1(Target 1)作為SD1基因編輯的靶位點(diǎn)。

2.2 CRISPR/Cas9基因編輯載體構(gòu)建

根據(jù)靶位點(diǎn)的序列，合成兩條引物Oligo-F和Oligo-R(表1)。將Oligo-F和Oligo-R混合復(fù)性后獲得的靶位點(diǎn)片段與用BbsⅠ酶切后的psgR-Cas9-Os載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定所用引物為M13-F和Oligo-R，在陽性克隆中可以鑒定出253 bp的條帶。共鑒定了8個(gè)克隆，其中有5個(gè)克隆正確(圖2)，選取1號(hào)克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，并將最終獲得的載體命名為psgR-Cas9-Os-SD1。

將載體psgR-Cas9-Os-SD1用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，回收5.6 kb的片段，然后與經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切回收的pCAMBIA1300載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，再次用引物M13-F和Oligo-R進(jìn)行菌落PCR鑒定，共鑒定了8個(gè)克隆，其中7個(gè)克隆為陽性克隆(圖2)，最后選取1號(hào)克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證正確，將獲得的CRISPR/Cas9基因編輯載體命名為CRISPR-SD1。

圖1 水稻SD1氨基酸序列的比對(duì)Fig.1.Comparison of rice SD1 amino acid sequence.

表2 水稻SD1基因中的CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)Table 2.Putative CRISPR/Cas9 target sites in rice SD1 gene.

圖2 陽性克隆的菌落PCR篩選Fig.2.Screening positive clone by colony PCR.

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株靶位點(diǎn)突變類型分析

CRISPR-SD1載體用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻恢復(fù)系申繁17和申繁24的愈傷組織，用潮霉素篩選獲得轉(zhuǎn)基因苗。申繁17和申繁24分別獲得了10株和18株T0代轉(zhuǎn)基因苗。用載體特異的引物M13-F和Oligo-R進(jìn)行PCR鑒定，在10株申繁17的轉(zhuǎn)基因苗中，有3株陽性苗，而在18株申繁24的轉(zhuǎn)基因苗中，有5株陽性苗。

為了分析這8株陽性轉(zhuǎn)基因苗中的SD1靶位點(diǎn)序列是否已經(jīng)被編輯，用引物SEQ1-F和SEQ1-R在轉(zhuǎn)基因苗中擴(kuò)增包含SD1基因靶位點(diǎn)的DNA片段，進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這8株轉(zhuǎn)基因苗中，靶位點(diǎn)序列都發(fā)生了不同類型的突變。其中有4個(gè)株系插入1個(gè)堿基，還有另外4個(gè)株系發(fā)生了不同數(shù)目堿基的缺失突變(圖3)。

圖3 T0代轉(zhuǎn)基因株系中SD1基因突變類型的分析Fig.3.Mutation type in SD1 gene of T0transgenic lines.

在8個(gè)突變株系中除了繁17-1和繁24-8兩個(gè)株系的突變分別導(dǎo)致缺失5和23個(gè)氨基酸外，其他的突變株系的突變都導(dǎo)致了移碼突變使得翻譯提前終止。在T1突變體中發(fā)現(xiàn)繁17-1和繁24-8的株高與其野生型相比沒有顯著的變化。而其他突變株系的株高與野生型相比顯著降低，且同一個(gè)品種不同突變株系之間株高的差異不顯著。

2.4 不含轉(zhuǎn)基因的矮稈突變體的獲得

為了獲得不含轉(zhuǎn)基因(T-DNA)序列的矮稈申繁17和申繁14株系，選取2個(gè)純合的轉(zhuǎn)基因株系繁17-4和繁24-5開展進(jìn)一步研究。這2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系分別種植24株T1代植株，在苗期分別取單株葉片，提取DNA，用轉(zhuǎn)基因載體的特異性引物M13-F和Oligo-R，以及潮霉素和Cas9基因特異的引物進(jìn)行PCR鑒定，在繁17-4和繁24-5的T1代群體中，分別鑒定出了10株和8株不含轉(zhuǎn)基因載體序列的單株(圖4)。同時(shí)，對(duì)不含轉(zhuǎn)基因載體序列單株的靶基因位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示T1代中的靶位點(diǎn)突變和上一代是一致的，說明用CRISPR/Cas9基因編輯獲得的突變是可以穩(wěn)定遺傳的。在此，分別將獲得的不含轉(zhuǎn)基因載體片段的繁17-4和繁24-5株系命名為矮繁17和矮繁24。在T2代，測(cè)量了矮繁17和矮繁24株高、有效穗數(shù)、穗長、千粒重、每穗粒數(shù)和結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀，發(fā)現(xiàn)與它們各自的野生型申繁17和申繁24相比，除了株高出現(xiàn)顯著下降外(下降約25%)，而其他農(nóng)藝性狀均沒有出現(xiàn)顯著的改變(圖 5)。

圖4.T1代中不含轉(zhuǎn)基因載體序列植株的PCR篩選Fig.4.PCR screening of transgenic-free plants in T1generation.

圖5 野生型與T2代sd1突變體的農(nóng)藝性狀(n=20)Fig.5.Agronomic traits of wild type and T2-generation sd1 mutants(n=20).

3 討論

水稻矮稈品種的選育和應(yīng)用是水稻育種領(lǐng)域的一個(gè)重大的突破[23]，過去一般利用與矮源品種進(jìn)行雜交，并結(jié)合表型或分子標(biāo)記輔助選擇的方法進(jìn)行矮稈品種選育，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。現(xiàn)代分子生物技術(shù)育種的興起為矮稈育種提供了一些比較快捷高效的手段，可以直接抑制或者敲除矮稈基因，而不改變基因組中其他基因的序列和表達(dá)水平，從而可以獲得預(yù)期的株高表型，而對(duì)其他的性狀不會(huì)有影響。Qiao等[26]利用RNAi技術(shù)抑制半矮稈基因SD1的表達(dá)，獲得了半矮稈的水稻品種。然而RNAi技術(shù)本身存在一些缺點(diǎn)，限制了RNAi技術(shù)在作物分子育種領(lǐng)域的應(yīng)用。比如RNAi技術(shù)常常存在脫靶的問題，一些和靶基因序列相近的基因表達(dá)也會(huì)受到抑制；RNAi技術(shù)通過降解靶基因的mRNA進(jìn)行基因干涉，降低其表達(dá)水平，而非完全敲除靶基因的功能[27]?；蚓庉嫾夹g(shù)，特別是CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展，使得RNAi技術(shù)在功能基因組學(xué)和作物分子育種領(lǐng)域的應(yīng)用正迅速地被取代。

Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻進(jìn)行基因編輯，在T0代轉(zhuǎn)基因植株中即可獲得純合的基因突變植株，并且這些突變可以穩(wěn)定遺傳給下一代。由于轉(zhuǎn)基因過程中，如果轉(zhuǎn)基因是單拷貝插入的情況下，根據(jù)孟德爾遺傳定律，在T1轉(zhuǎn)基因的群體中，就會(huì)出現(xiàn)1/4的植株不含轉(zhuǎn)基因序列。因此，從理論上講用CRISPR/Cas9技術(shù)，在第2代就可以獲得不含轉(zhuǎn)基因的突變體。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)粳稻恢復(fù)系申繁17和申繁24進(jìn)行SD1基因編輯，發(fā)現(xiàn)在獲得的8個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，有5個(gè)株系在T0代就獲得了純合的sd1突變。選取其中2個(gè)純合的轉(zhuǎn)基因株系繁17-4和繁24-5分別種植成T1群體，篩選出了不含轉(zhuǎn)基因序列的個(gè)體，并且這些個(gè)體中SD1的突變方式與T0一致，說明CRISPR/Cas9技術(shù)編輯后的突變位點(diǎn)可以穩(wěn)定地遺傳給下一代。株高測(cè)定結(jié)果表明，CRISPR/Cas9技術(shù)編輯后獲得的半矮稈品種的株高與其野生型相比大約降低25%。本研究結(jié)果表明CRISPR/Cas9技術(shù)是一種非常有效的水稻矮稈育種工具。

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