方東輝，付茂忠，唐 慧，甘 佳，王 淮，易 軍，王 巍

（四川省畜牧科學研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都 610066）

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）被世界衛(wèi)生組織癌癥機構認定為Ⅰ類致癌物（WHO，1993）［1］。在所有黃曲霉毒素中，B1的毒性最強，黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性約為氰化鉀的10倍，三氧化二砷的68倍，致癌性為二甲基亞硝胺的75倍，奶油黃的900倍［2］。常見的幾種AF的毒性按大小順序排列依次為 B1＞M1＞G1＞B2＞G2。黃曲霉廣泛存在于自然界，潮濕易發(fā)霉的植物和食品中易滋生。飼料中污染的黃曲霉毒素以B1最多見，毒性和致癌性最強。各種畜禽對它的敏感性不一樣，其順序大致為仔豬>犢牛>肥育豬>成年牛>綿羊。但奶牛采食的飼料原料種類繁多，而且采食總量也較其他動物更多，因而奶牛接觸霉菌毒素的種類及概率高于其他動物［3-4］。奶牛采食AFB1污染的飼料后，很少一部分會在瘤胃中被降解，剩下的大部分AFB1在消化道被吸收，但吸收率相對較低［4］。進入動物機體的AFB1在肝臟內被羥基化成黃曲霉毒素 M1（AFM1）［5-6］。有試驗證明，日糧中AFB1轉化為乳中AFM1的效率與精料水平關聯(lián)密切。高產母牛由于飼料采食量大，食入的AFB1多，轉化效率可高達6%［7］。四川省地處亞熱帶季風氣候，夏季高溫高濕、冬季低溫高濕，更容易導致飼料霉變滋生黃曲霉，從而影響奶牛生產。因此，本試驗以濕熱環(huán)境下蜀宣花牛產奶母牛為試驗對象，通過體外培養(yǎng)法研究不同水平的黃曲霉毒素B1對瘤胃微生物代謝的影響，旨在探究奶牛瘤胃中黃曲霉毒素B1的最大耐受濃度。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇安裝永久性瘤胃瘺管的3頭蜀宣花牛產奶母牛（540 kg±28 kg）作為供體牛開展試驗，飼喂 TMR，自由飲水，日糧情況見表1。

表1 TMR日糧組成及營養(yǎng)成分含量%

1.2 試驗設計

將TMR飼料烘干粉碎，經60目篩制后作為底物，采集供體牛的瘤胃液進行體外培養(yǎng)。本研究設置4個試驗組和1個對照組，每種處理均設3個重復，分別為A組（瘤胃液中添加0.1μg/mLB1）、B組（添加1μg/mL B1）、C 組（添加 5μg/mL B1）、D 組（添加 10 μg/mL B1）和cg組（對照組，不添加），B1由FERMENTEK公司生產。各試驗組在體外發(fā)酵裝置中（自研）培養(yǎng)0，2，4，8，12和24 h后取樣，測定培養(yǎng)液的pH值、氨態(tài)氮和VFA。

1.3 方法

1.3.1 瘤胃液的采集 晨飼后2 h采集供體奶牛瘤胃液各300mL，置于飽和CO2保溫瓶中迅速帶回實驗室后用4層紗布過濾，39℃水浴保溫并持續(xù)通入CO2直至分裝使用。

1.3.2 體外培養(yǎng) 分別精確稱取2.00 g TMR飼料底物于不同組號的錐形瓶中。用蒸餾水將AFB1溶液稀釋成0.01，0.1，0.5，1.0mg/mL 的溶液，各取 1mL AFB1 稀釋溶液于對應錐形瓶中，對照組加入1mL蒸餾水。取人工唾液與瘤胃液混合液（人工唾液與瘤胃液比例為2∶1）99mL于各個錐形瓶中混合均勻，置于39℃的恒溫水浴搖床上培養(yǎng)0，2，4，8，12和24 h，取培養(yǎng)液經離心處理后待分析。人工唾液配置參照Menke等［8］方法。

1.3.3 pH值測定 發(fā)酵結束采完氣體樣后用pH計測定發(fā)酵液的pH值。

1.3.4 氨態(tài)氮和VFA的測定 取1.0 mL的發(fā)酵液在4℃下10 000×g離心10min，取上清液加0.3mL的25%（w/v）偏磷酸混勻，4℃靜置 30min，然后 10 000×g離心10min，取上清液待分析。發(fā)酵液中氨態(tài)氮濃度采用靛酚比色法測定［9］。揮發(fā)性脂肪酸濃度測定采用氣相色譜法外標法進行測定［10］。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件中的單因素ANOVA進行方差分析，差異顯著時采用Duncan氏法進行多重比較，結果以平均數(shù)±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 不同添加量AFB1對底物pH值變化的影響

由表2可見，發(fā)酵2 h之前所有試驗組pH值均小幅升高，2 h后顯著下降，其中2～4 h的下降速率最大。4 h時D組pH值極顯著高于其他各組（P<0.01），8 h時D組pH值也極顯著高于其他各組（P<0.01）。

表2 不同添加水平AFB1對體外發(fā)酵瘤胃液pH值的影響

瘤胃液pH值的變化受日糧性質有機酸積聚和唾液分泌量的影響，其可反映瘤胃的綜合發(fā)酵水平［11］。pH值隨瘤胃微生物對發(fā)酵底物的分解產生NH3-N和揮發(fā)性脂肪酸等產物而發(fā)生變化，其正常變化范圍是5.5～7.5，pH值過高或者過低對瘤胃微生物生長、繁殖及底物發(fā)酵均造成不利的影響。當pH值低于下限時，瘤胃內的微生物活力降低，數(shù)量減少或完全被酸性環(huán)境殺死。本試驗發(fā)酵8 h內，pH值均在5.54～7.51之間，12 h后，各組pH值均處于下限水平。因此，體外發(fā)酵其他指標只利用12 h之內的數(shù)據(jù)進行分析。

2.2 不同添加量AFB1對底物氨氮濃度的影響

由表3可見，添加0.1μg/mL B1后，氨態(tài)氮濃度的變化模式與對照組基本一致，均為2 h內下降，2～8 h緩慢上升，12 h后迅速下降，且各時間節(jié)點兩組間差異均不顯著（P>0.05）。添加 1μg/mLB1時，8 h以內，氨氮濃度變化模式與對照組一致，且各時間節(jié)點兩組間差異也不顯著（P>0.05）；8～12 h，氨氮濃度則出現(xiàn)下降且極限值均低于對照組（P<0.01）和 A 組（P<0.01）；12～24 h，氨氮濃度無明顯變化，24 h時氨氮濃度與對照組和A組間差異均不顯著（P>0.05）。添加5μg/mLB1時，2 h以內，氨氮濃度變化模式與對照組一致，且兩組間差異均不顯著（P>0.05）；2～4 h，氨氮濃度上升且顯著高于對照組（P<0.05）和 A 組（P<0.05）；4～12 h，氨氮濃度下降，12 h的氨氮濃度極顯著低于對照組（P<0.01）和A組（P<0.01），顯著低于B 組（P<0.05）；12～24 h，氨氮濃度上升，24 h氨氮濃度與對照組、A組和B組間差異均不顯著（P>0.05）。添加10μg/mL B1時，2 h以內，氨氮濃度變化模式與對照組一致，且兩組間差異均不顯著（P>0.05）；2～4 h，氨氮濃度緩慢上升，且極顯著低于B組、C組和對照組（P<0.01）；4～12 h，氨氮濃度下降，且極顯著低于其它各組（P<0.01）；12～24 h，氨氮濃度上升，24 h氨氮濃度也極顯著低于其他各組（P<0.01）。

氨氮是瘤胃內飼料蛋白質肽氨基酸氨化物尿素和其他非蛋白氮化合物分解的終產物，同時又是微生物合成菌體蛋白的主要原料［12］。適宜的NH3-N濃度是瘤胃氮代謝重要的中間環(huán)節(jié)。本試驗氨氮濃度的變化符合瘤胃微生物最佳生長所需濃度（5～28mg/100mL）的要求［13］。本試驗發(fā)現(xiàn)，添加 1 μg/mLB1 和 5 μg/mLB1時，氨氮濃度在8 h后均極顯著下降；添加10μg/mLB1時，氨氮在2 h后極顯著下降。說明添加黃曲霉毒素B1會降低微生物降解蛋白質的活性，且隨著B1濃度的升高，微生物降解能力下降的起始時間節(jié)點逐步提前。

表3 不同添加水平AFB1對體外發(fā)酵瘤胃液氨氮濃度的影響mg/100mL

2.3 不同添加量AFB1對揮發(fā)性脂肪酸產量的影響

如表4所示，在體外發(fā)酵裝置中培養(yǎng)12 h時，添加10μg/mLB1組的乙酸濃度顯著低于對照組（P<0.05），與其余各試驗組間均差異不顯著（P>0.05）；各組間丙酸濃度均差異不顯著（P>0.05）；添加10μg/mL組總揮發(fā)性脂肪酸濃度顯著低于對照組（P<0.05），與其余各組間均差異不顯著（P>0.05）。

有研究發(fā)現(xiàn)，在瘤胃微生物體外靜態(tài)培養(yǎng)中添加不同濃度的AFB1，可減少總揮發(fā)性脂肪酸的產量，乙酸、丙酸、丁酸和戊酸產量也逐漸下降（P<0.05）［14］。本研究結果表明，10μg/mLB1組的VFA濃度較低，說明該水平下微生物活性較弱，不利于瘤胃發(fā)酵。Mertens等［15］研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物對AFB1很敏感，添加AFB1會擾亂瘤胃微生物的生長和功能，進而會改變VFA的組成比例。乙酸是由微生物慢速發(fā)酵飼料中纖維物質生成的，乙酸含量的高低可反映微生物降解纖維的活性。本研究結果表明，添加10μg/mL組的乙酸比例較低，因此推測，10μg/mL水平下纖維分解菌的活性相對受到抑制。

表4 不同黃曲霉毒素B1添加水平對體外發(fā)酵12 h混合物VFA濃度的影響mmol/L

3 小結

（1）本試驗結果表明，4 h和8 h時添加10μg/mL B1組的pH值均極顯著高于其他各組（P<0.01）。

（2）添加1μg/mLB1和5μg/mLB1時，氨氮濃度在8 h后極顯著下降，添加10μg/mLB1時，氨氮在2 h后極顯著下降。說明添加黃曲霉毒素B1能夠降低微生物降解蛋白質的活性，隨著B1濃度的升高，微生物降解能力下降的起始時間節(jié)點逐步提前。

（3）添加10μg/mLB1組的VFA濃度較低，說明該水平下微生物活性較弱，不利于瘤胃發(fā)酵，且添加10μg/mL B1組的乙酸比例較低，因此推測，10μg/mLB1水平下纖維分解菌的活性相對受到抑制。

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