王 巍 ，方東輝 ，甘 佳 ，付茂忠 ，唐 慧 ，曹 偉 ，楊 嵩 ，楊和琴 ，王 淮 ，易 軍

（1.四川省畜牧科學研究院，成都 610066；2.四川省畜牧總站，成都 610041；3.四川省金川縣農業(yè)畜牧和水務局，金川 624100）

熱應激是指高濕熱環(huán)境中機體對熱環(huán)境所做出的非特異性生理反應的總和［1］，可引起機體必要激素分泌受阻、新陳代謝出現(xiàn)不可逆變化，進而影響機體多項功能的發(fā)揮［2］。隨著畜牧業(yè)集約化和產業(yè)化程度的提高，飼養(yǎng)密度不斷增大，夏季熱應激對種公牛生殖系統(tǒng)機能以及精液品質的影響越來越顯著［3］。許多種牛場受夏季高溫的影響，采精量減少且精液品質不能達到國家標準，被迫停產，直接降低了經濟效益。近年來，研究發(fā)現(xiàn)血小板活化因子（PAF）作為一種獨特的乙?；牧字c哺乳動物精子的活力、頂體反應、獲能和受精能力密切相關，能夠直接影響排卵、受精、附植前胚胎的發(fā)育、胚胎的附植、妊娠乃至分娩［4-5］。通過外源性試驗發(fā)現(xiàn)，PAF可以提高人精子的活力［6］。多種動物的精子檢測發(fā)現(xiàn)，PAF作為一類乙?；母视土字?，是精子原生質膜的脂質類成分之一［7］，具有誘發(fā)質膜囊泡化的特性，是精子頂體反應的內源誘導者［8］，可以提高精子的活力，增加低活力精子的運動速度。目前關于具有不同抗逆特色牛品種間PAF差異表達模式的研究尚屬空白。

本研究以西門塔爾牛和耐濕熱新品種蜀宣花牛公牛為研究對象，分析濕熱環(huán)境下不同抗逆品種間PAF的差異表達模式，明確抗逆品種蜀宣花牛精液中PAF的特色表達模式，為提高種公牛精子活力相關技術規(guī)程的制定提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇2月齡左右的5頭蜀宣花牛和10頭西門塔爾牛公牛，統(tǒng)一飼養(yǎng)于宣漢縣蜀宣花牛養(yǎng)殖專業(yè)合作社，確保飼養(yǎng)條件一致。飼料配方見表1。

表1 精料補充料配方%

1.2 環(huán)境THI測定

在牛舍中部距地面1.5m處掛置干、濕球溫度計，于2016年9月至2017年3月每日記錄9:00、12:00和17:00的干濕溫度，利用Sandy Stokes提出的THI公式測定環(huán)境溫濕指數(shù)。THI計算公式如下：

式中：Td為溫度，Tw為相對濕度。

1.3 樣本采集

每隔5天對實驗牛進行人工采精，將采集的精液放入一次性無菌干燥帶蓋塑料容器內，置37℃恒溫水浴箱中，待完全液化后用計算機輔助的精液分析系統(tǒng)（Computer-assisted semen analysis，CASA） 進行精液常規(guī)分析，收集剩余的精液以4 000 r/min離心10min，取上層精漿置于Ep管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ELISA法檢測

取標本嚴格按照牛血小板活化因子（PAF）ELSIA試劑盒（試劑盒購自R&D上?？準妫┱f明書操作，檢測PAF，15min內用酶標儀450 nm波長讀取OD值。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，以x±S表示，PAF表達的組間比較均先進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，視分布情況及方差齊性情況進行t檢驗。精漿中PAF表達的相關性分析，視是否呈正態(tài)分布采用直線相關分析或Spearman秩相關分析，求相關系數(shù)（r），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 環(huán)境溫度變化趨勢

實驗收集了2016年4月至2017年3月實驗牛舍的溫度及濕度數(shù)據(jù)，計算出THI指數(shù)值，結果見圖1。

國際上按THI指數(shù)值將熱應激劃分為5個等級：THI<72時無熱應激，7298時為致死應激。如圖1所示，實驗期間7月和8月12:00時，牛舍THI指數(shù)值均在80以上，屬中等應激；8:00和20:00的THI指數(shù)值在72以上，為溫和應激。6月和9月牛舍THI指數(shù)值為70～75，為溫和應激。

圖1 圈舍全年THI指數(shù)

2.2 牛精液質量的動態(tài)變化模式

由圖2可見，2016年9月—2017年3月的西門塔爾牛和蜀宣花牛精液密度變化模式相同，均呈S型曲線，9月精液密度最低，2月份和3月份最高。兩個品種牛的精子密度均在9—11月份上升速度較快，11—翌年1月份處于平臺期，1—3月份緩慢上升。蜀宣花牛各月份的精液密度均高于西門塔爾牛，其中9—11月份，蜀宣花牛的精液密度極顯著高于西門塔爾牛（P<0.01），2—3月份，與西門塔爾牛差異不顯著（P>0.05）。

圖2 精液密度的變化模式

由圖3可知，蜀宣花牛的精子活力變化曲線較為平緩，基本在60%左右，12月份開始穩(wěn)定在60%以上。西門塔爾牛的精子變化模式為S型曲線，9月份最低，2月份和3月份最高。9月份至翌年1月份呈上升趨勢，2月份開始基本維持在65%。

圖3 精子活力的變化模式

有實驗表明，對公牛做24～72 h的陰囊人工局部熱處理，使陰囊皮溫升高1℃，引起精液品質下降［9］。兔子的熱應激控制實驗表明，熱應激致使采精量、精子活力和密度顯著下降（P＜0.05），精子畸形率顯著升高（P＜0.05）［10］。本研究結果與上述研究結論相一致，7—8月份的中等熱應激使公牛在9月份生產的精液密度和活力下降；12月份和1月份未出現(xiàn)熱應激，因此2月份精液密度和活力回升。其中西門塔爾牛的精液密度和精子活力僅為2月份的37%和38%；蜀宣花牛的精液密度和精子活力為2月份的45%和89%。表明熱應激對兩個品種牛的精子質量均造成了影響。9—10月份，蜀宣花牛的精子密度和活力均極顯著高于西門塔爾牛（P＜0.01），說明熱應激對蜀宣花牛精子質量的影響小于西門塔爾牛。研究表明，熱應激能夠抑制下丘腦-垂體-睪丸軸的功能，睪丸分泌的雄性激素下降，從而抑制了精母細胞發(fā)育，使種公牛繁殖機能下降［11］，或者直接影響牛精液品質及頂體反應相關酶的活力，從而改變精液密度和精子活力［12］。推測蜀宣花牛在神經體液調節(jié)系統(tǒng)和精液品質相關調節(jié)酶活性表達模式方面存在特異性，以應對濕熱環(huán)境對機體的影響。

2.3 不同品種牛PAF的差異表達模式及其與精液質量的相關性分析

如圖4所示，蜀宣花牛的PAF變化模式與西門塔爾牛的PAF變化模式存在顯著差異。蜀宣花牛PAF表達量標化模式呈二階段式，9—12月份蜀宣花牛的PAF表達量平均3.92 ng/mL，1—3月份平均3.08 ng/mL。西門塔爾牛的PAF表達量變化模式呈半拋物線，9月份最高，為6.10 ng/mL，3月份最低，為3.02 ng/mL。兩個品種牛各月份的PAF表達量存在差異。2016年9月—2017年1月份，蜀宣花牛的PAF表達量極顯著低于西門塔爾牛（P<0.01）。2—3月份，兩個品種牛的PAF表達量差異不顯著（P>0.05）。

圖4 PAF的表達模式

通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，西門塔爾牛精液中PAF的活性與精液密度和精子活力均呈極顯著負相關（P＜0.01，r=-0.934；P＜0.01，r=-0.953）；蜀宣花牛的精液中PAF活性與精液密度呈極顯著負相關（P＜0.01，r=-0.912），與精子活力呈顯著負相關（P＜0.05，r=-0.848）。

研究發(fā)現(xiàn)，夏季公豬精漿中的PAF表現(xiàn)較高活性，但動物精液的質量較差［13］。大量研究證明，精液中PAF的含量與精子活力呈顯著負相關［5］，與本研究結果相一致。表明牛的精液PAF表達情況與精子質量呈負相關。濕熱環(huán)境下，蜀宣花牛的PAF表達量變化模式與西門塔爾牛間存在差異，且極顯著低于西門塔爾牛（P<0.01），說明蜀宣花牛精子品質相關蛋白PAF的特異性表達模式是導致蜀宣花牛在濕熱環(huán)境下仍保持精子質量的原因之一。

3 結論

牛的精液PAF表達情況與精子質量呈負相關，熱應激對蜀宣花牛精子質量的影響小于西門塔爾牛。

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