韓 璐，胡 濤，丁雪峰，楊 玉

(吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科;2.內(nèi)分泌科,吉林 吉林132000)

腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞作為腎間質(zhì)的固有細(xì)胞，是腎臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要生成細(xì)胞，約占腎組織細(xì)胞總數(shù)的6%。研究表明，在高糖等因素作用下，正常腎臟中相對(duì)靜止的成纖維細(xì)胞可被激活，表現(xiàn)出明顯增殖活性，同時(shí)刺激合成多種ECM成分，包括膠原(collagen)、纖連蛋白(FN)、彈性蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖等，參與腎間質(zhì)纖維化過(guò)程。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)被認(rèn)為是強(qiáng)效的致纖維化因子，在多種組織器官纖維化中起重要作用。大量研究顯示，二者在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中也具有重要作用[1,2]。有學(xué)者認(rèn)為，活化的成纖維細(xì)胞可發(fā)生功能和表型改變，即轉(zhuǎn)變?yōu)榭杀磉_(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的肌成纖維細(xì)胞(MFB)，后者數(shù)量的多少與間質(zhì)纖維化輕重程度密切相關(guān)，可以作為判斷慢性腎臟疾病一個(gè)很好的指標(biāo)[3]。本研究旨在探討高糖對(duì)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞株NRK49f TGF-β、CTGF及α-SMA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞株NRK49f購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。DMEM高糖及低糖培養(yǎng)基為Invitrogen產(chǎn)品，胎牛血清產(chǎn)自天津?yàn)笊锛夹g(shù)公司。兔抗大鼠TGF-β、CTGF及α-SMA多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗兔多克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。ECL顯色試劑盒為武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司產(chǎn)品。細(xì)胞裂解液、Bradford 法蛋白檢測(cè)試劑盒由碧云天生物技術(shù)公司生產(chǎn)。TRizol為Invitrogen產(chǎn)品，二步法實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑盒為全式金生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞分組將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按1×106/孔接種至6孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，將培養(yǎng)細(xì)胞換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)12 h后，用無(wú)血清高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h及48 h，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，即繼續(xù)用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)現(xiàn)重復(fù)3次。

1.3WesternBlot檢測(cè)各組細(xì)胞于培養(yǎng)結(jié)束后，吸取培養(yǎng)上清并用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌細(xì)胞2次，每孔加300 μl細(xì)胞裂解液反復(fù)吹打以充分裂解細(xì)胞，經(jīng)蛋白定量后按50 μg/孔行聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳并經(jīng)轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉后，用兔抗大鼠TGF-β、CTGF及α-SMA多克隆抗體4℃孵育過(guò)夜，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗兔多克隆抗體37℃孵育2 h，充分洗膜后用ECL法顯色、曝光后測(cè)量X光膠片上條帶密度。

1.4實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞于培養(yǎng)結(jié)束后，吸取培養(yǎng)上清并用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌細(xì)胞2次后，按TRizol說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，并二步法實(shí)時(shí)定量RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并用TGF-β、CTGF及α-SMA特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。按2-ΔΔCt計(jì)算各組細(xì)胞TGF-β和CTGF的相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt=(實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct)-(對(duì)照組目的基因Ct-對(duì)照組內(nèi)參基因Ct)[4]。

PCR引物序列分別為：TGF-β正意義鏈5’-CCAAGGAGACGGAATACAGG-3’， 反意義鏈5’-GTGTTGGTTGTAGAGGGCAAG-3’；CTGF正意義鏈5’-CTAAGACCTGTGGAATGGGC-3’， 反意義鏈5’-CTCAAAGATGTCATTGCCCCC-3’。以GAPDH為內(nèi)參照，引物序列為正意義鏈5’-ACTGAGCATCTCCCTCAC-3’， 反意義鏈5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞TGF-β和CTGFwesternblot檢測(cè)結(jié)果高糖DMEM作用于NRK49f 12 h即可見(jiàn)TGF-β、CTGF蛋白表達(dá)均有增加趨勢(shì)，并持續(xù)增高，與正常對(duì)照組比較，高糖刺激24 h及48 h組TGF-β相對(duì)表達(dá)量均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且與高糖12 h組比較，二者相對(duì)表達(dá)量變化明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)圖1，表1。

圖1 各組細(xì)胞TGF-β和CTGF western blot檢測(cè)結(jié)果

表1 各組細(xì)胞TGF-β和CTGF western blot檢測(cè)結(jié)果

2.2各組細(xì)胞TGF-β和CTGF實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果高糖DMEM作用于NRK49f 12 h即可見(jiàn)TGF-β、CTGF mRNA表達(dá)均增加，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，二者表達(dá)量持續(xù)增加，至高糖刺激培養(yǎng)細(xì)胞24 h及48 h時(shí)，二者相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組及高糖培養(yǎng)12 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞TGF-β和CTGF 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3各組細(xì)胞α-SMA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，正常組NRK49f細(xì)胞未檢測(cè)到α-SMA表達(dá)，高糖DMEM作用于NRK49f 24 h時(shí)可見(jiàn)α-SMA表達(dá)條帶，至高糖DMEM培養(yǎng)48 h時(shí)，α-SMA表達(dá)量明顯高于24 h高糖DMEM培養(yǎng)組，見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞α-SMA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是各種原因所致腎臟損傷的最終結(jié)果，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞是腎間質(zhì)纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞。研究表明，糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)中成纖維細(xì)胞明顯增生及ECM生成，腎間質(zhì)TGF-β、CTGF蛋白及mRNA表達(dá)亦明顯增加[5,6]。李海劍等[7,8]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明，高糖可刺激腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖及ECM表達(dá)。這些研究表明高糖可引發(fā)或加速腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程。

TGF-β分子量25 kD，由兩個(gè)分子量為12.5 kD的亞基通過(guò)二硫鍵連接而成的同源二聚體，二聚體形式的TGF-β才有生物活性。現(xiàn)已證明，TGF-β是腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中最重要的生長(zhǎng)因子之一，在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)起作用。研究表明，TGF-β除直接刺激腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞ECM產(chǎn)生外，還可通過(guò)促進(jìn)纖溶酶原激活物抑制物(PAI)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物(TIMPs)的合成而減少ECM降解。CTGF是在TGF-β下游起作用的介質(zhì)。在CTGF啟動(dòng)子上有一個(gè)特殊的TGF-β反應(yīng)元件，TGF-β通過(guò)此元件誘導(dǎo)CTGF表達(dá)，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的形成。黃海長(zhǎng)等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，CTGF可修飾或放大TGF-β1的促成纖維細(xì)胞生成作用。本研究中，高糖培養(yǎng)液作用于NRK49f 12 h即可見(jiàn)其TGF-β和CTGF的表達(dá)增加，并隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而繼續(xù)增加，至24 h和48 h時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞TGF-β和CTGF的表達(dá)已明顯高于對(duì)照組，表明在體外，高糖可明顯刺激腎間質(zhì)成纖維TGF-β和CTGF的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。

α-SMA是常用的肌細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白，常用于平滑肌細(xì)胞的鑒定。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β、CTGF均可刺激大鼠腎臟成纖維細(xì)胞合成向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，即由本來(lái)不表達(dá)α-SMA的腎小管成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為有α-SMA表達(dá)的肌成纖維細(xì)胞。本研究中，高糖刺激NRK49f 24 h后，NRK49f出現(xiàn)α-SMA的表達(dá)，表明其向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

綜上所述，高糖可刺激體外培養(yǎng)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞表達(dá)TGF-β和CTGF的轉(zhuǎn)錄和翻譯，并可刺激其表達(dá)α-SMA，這可能是糖尿病腎病致腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制之一。

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