李 洋 王 洋 許 健 趙 冬 劉 祺

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832000

垂體腺瘤是一種常見的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，占所有顱內(nèi)腫瘤的10%～15%，多表現(xiàn)為良性，但仍有部分腺瘤呈侵襲性生長(zhǎng)，表現(xiàn)為破壞鞍底骨質(zhì)、侵犯海綿竇壁、包繞頸內(nèi)動(dòng)脈等，這類腫瘤被定義為侵襲性垂體腺瘤(invasive pituitary adenomas，IPA)[1]。目前，IPA手術(shù)全切困難，術(shù)后易復(fù)發(fā)，治愈率較低，多數(shù)表現(xiàn)為“惡性腫瘤”特征，盡管多學(xué)科協(xié)作團(tuán)隊(duì)模式(Multi-disciplinary Team，MDT)已被運(yùn)用于IPA的診治，但仍有部分患者在首次治療后表現(xiàn)出生長(zhǎng)速度過快、對(duì)常規(guī)治療抵抗及頻繁復(fù)發(fā)等征象[2-3]。近年來，預(yù)測(cè)垂體腺瘤侵襲性生物學(xué)標(biāo)記物成為研究熱點(diǎn)[4]。本研究檢測(cè)Fascin、Ki-67的表達(dá)情況，并分析它們與Knosp分級(jí)的相關(guān)性，以期對(duì)侵襲性垂體瘤的診斷及治療提供更多幫助。

1 對(duì)象和方法

1．1臨床資料收集2013-06—2017-02石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科診治的垂體腺瘤患者資料共60例，收集一般資料(臨床基本信息、術(shù)前、術(shù)后影像學(xué)檢查、術(shù)后病理結(jié)果)，其中侵襲性垂體腺瘤30例，非侵襲性垂體腺瘤30例，男33例，女27例，年齡29～82歲(平均48.9歲)。免疫組織化學(xué)確定激素類型為GH腺瘤7例，PRL腺瘤9例，ACTH腺瘤2例，TSH腺瘤1例，混合型腺瘤33例，無(wú)功能性腺瘤8例。

1．2 IPA的診斷標(biāo)準(zhǔn)Knosp[1]分級(jí)：0級(jí)：腫瘤未超過頸內(nèi)動(dòng)脈血管管徑的內(nèi)切連線，海綿竇未受累；Ⅰ級(jí)，腫瘤位于頸內(nèi)動(dòng)脈血管管徑的中心連線內(nèi)，海綿竇內(nèi)側(cè)部靜脈叢消失；Ⅱ級(jí)：腫瘤位于頸內(nèi)動(dòng)脈血管管徑的外切連線內(nèi)，海綿竇上部和下部靜脈叢消失；Ⅲ級(jí)：腫瘤超過頸內(nèi)動(dòng)脈血管管徑的外切連線，突到海綿竇外；Ⅳ級(jí)：海綿竇內(nèi)頸內(nèi)動(dòng)脈被腫瘤包裹，靜脈叢消失，Ⅰ～Ⅱ級(jí)定義為NIPA，Ⅲ～Ⅳ級(jí)定義為IPA。

1．3免疫組化實(shí)驗(yàn)方法所有組織標(biāo)本均以4%甲醛固定，石蠟包埋，4μm厚度連續(xù)切片，免疫組織化學(xué)染色采用Envision法：切片脫蠟，酒精水化，微波抗原修復(fù)及過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗后，分別滴加一抗(兔單克隆抗體Fascin，1：200，Abcam；兔抗人增殖細(xì)胞抗原Ki-67，1：600，中杉金橋)，4 ℃孵育過夜，37 ℃復(fù)溫30 min后PBS沖洗，分別滴加二抗后孵育30 min，再次PBS沖洗后DAB顯色，蘇木紫復(fù)染，酸酒精酸化，返藍(lán)，二甲苯透明，37 ℃烘干后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1．4結(jié)果判讀免疫組化結(jié)果由2名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師進(jìn)行判定，于光學(xué)顯微鏡下，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占視野中所有組織細(xì)胞中的比例及陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：(1)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評(píng)分：比例≤5%記為0分，比例在6%～25%范圍內(nèi)記為1分，比例在26%～50%范圍內(nèi)記為2分，在51%～75%范圍內(nèi)記為3分，>75%以上記為4分；(2)陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色為0分，輕度染色(淡黃色)為 1 分，中度染色(棕黃色) 為 2 分，重度染色(棕褐色)為 3 分。結(jié)果判定參照免疫反應(yīng)積分 IRS 半定量法，如表 1 所示。將表中 A、B 項(xiàng)得分相乘，0 分為陰性 (-)，1～2 分為弱陽(yáng)性(+)，3～6 分為中度陽(yáng)性(++)，超過 6 分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

表1 IRS半定量法得分評(píng)估表

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，F(xiàn)ascin 蛋 白免疫組織化學(xué)結(jié)果采用 Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，Ki-67蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果采用t檢驗(yàn)，以P<0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。χ2檢驗(yàn)用于Fascin、Ki-67蛋白表達(dá)水平與臨床病例特征關(guān)系的檢驗(yàn)，相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Speaman法，以雙側(cè)P<0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1垂體腺瘤中Fascin、Ki-67蛋白的表達(dá)和患者臨床特征的相關(guān)性60例垂體腺瘤患者中，36例患者年齡>50歲，24例患者年齡≤50歲；2組中男33例，女27例；影像學(xué)評(píng)判其腫瘤最大徑>3 cm 20例，腫瘤最大徑<3 cm 40例；激素分型單純PRL、GH、TSH、ACTH型共19例，混合型共33例，無(wú)功能型共8例，F(xiàn)ascin、Ki-67蛋白的表達(dá)和患者性別、年齡、腫瘤大小、激素類型無(wú)明顯相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fascin陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，以彌漫性存在為主，2組中Fascin蛋白的表達(dá)具有差異性(P<0.01)。Ki-67陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞核，呈棕褐色，侵襲性組中Ki-67的截?cái)嘀禐?.9±1.88，非侵襲組中Ki-67的截?cái)嘀禐?.6±0.73，2組中 Ki-67蛋白的表達(dá)具有差異性，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1、2，表3、4)。

表2 60例垂體腺瘤標(biāo)本中Fascin、Ki-67蛋白表達(dá)水平與臨床資料的相關(guān)性

注：低表達(dá)為免疫組化半定量分值<3，高表達(dá)為免疫組化半定量分值≥3，F(xiàn)ascin、Ki-67表達(dá)和性別、年齡、腫瘤大小、激素分型無(wú)明顯相關(guān)性，P>0.05

圖1 Fascin蛋白的表達(dá)情況(200×)，A為 NIPA，B為 IPA

表3 Fascin蛋白在垂體腺瘤中表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述

圖2 Ki-67蛋白的表達(dá)情況(200×)，A為 NIPA，B為IPA

表4 Ki-67蛋白在垂體腺瘤中表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述

2．3 Spearman相關(guān)性分析法Fascin(r=0.366、P<0.01)、Ki-67(r=0.454、P<0.01)蛋白的表達(dá)與垂體腺瘤Konsp分級(jí)呈正相關(guān)(表5)。

表5 垂體腺瘤侵襲性發(fā)生影響因素的Spearman相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

2004年WHO[5]對(duì)于垂體腺瘤進(jìn)行了新的分型，包括典型垂體腺瘤、非典型垂體腺瘤和垂體癌，IPA表現(xiàn)出的侵襲特征和惡性腫瘤仍有一定差別，只有垂體腺瘤出現(xiàn)腦、脊髓以及全身性的轉(zhuǎn)移才被稱之為垂體癌(pituitary carcinomas，PC)，部分學(xué)者認(rèn)為，侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤之間并無(wú)嚴(yán)格的界限，其區(qū)別僅在于侵襲能力的大小有所不同。DAI等[6]人在2016年發(fā)表在Oncotarget雜志的文章中對(duì)“侵襲性垂體腺瘤”的概念做了進(jìn)一步的完善和補(bǔ)充，稱之為“難治性垂體腺瘤”，新的分類可以早期對(duì)患者進(jìn)行個(gè)體化治療，極大的改善患者的預(yù)后，延緩腫瘤的復(fù)發(fā)。既往總結(jié)垂體腺瘤侵襲性的機(jī)制有以下幾點(diǎn)：解剖結(jié)構(gòu)的異常導(dǎo)致腫瘤侵襲；腫瘤新生血管形成；腫瘤細(xì)胞粘附和遷移(細(xì)胞絲狀偽足形成；細(xì)胞核的移動(dòng)和變形)；細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrixc，ECM)理化性質(zhì)改變；腫瘤細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)[7-10]。

腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一是細(xì)胞遷移和入侵，這其中需要肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組，絲狀偽足是細(xì)胞骨架突出的重要結(jié)構(gòu)，可使腫瘤細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜等天然結(jié)構(gòu)性屏障，就像細(xì)胞感覺器官與細(xì)胞外微環(huán)境進(jìn)行溝通，并參與細(xì)胞的基本功能，如細(xì)胞黏附、擴(kuò)散和遷移[9，11]。Fascin蛋白是肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族中的一員，由Bryan于20世紀(jì)70年代從海膽卵母細(xì)胞胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，由Fascin基因編碼[12]。主要集中于微絲、絲狀偽足等離子膜下方的肌動(dòng)蛋白骨架突起，其功能是在細(xì)胞突起中形成和穩(wěn)定平行肌動(dòng)蛋白束，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[9，13]，在大多數(shù)正常上皮組織中檢測(cè)到Fascin蛋白表達(dá)極少，但是在許多上皮組織來源的腫瘤組織中卻出現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象[14]，最近的一篇綜述表明[10]，在乳腺、結(jié)腸直腸癌和食管癌中，F(xiàn)ascin的高表達(dá)與增加患者病死率風(fēng)險(xiǎn)以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能提供了一個(gè)新的生物學(xué)標(biāo)記物對(duì)于早期診斷侵襲性和轉(zhuǎn)移性腫瘤。HUANG等[11]的研究已證實(shí)癌細(xì)胞可利用絲狀偽足向器官表面黏附和侵襲，而Fascin的一種小分子抑制劑G2可以有效地抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移，JAYO發(fā)表在Development Cell的文章中[15]描述細(xì)胞核膜蛋白nesprin-2可以聯(lián)合Fascin蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞核的運(yùn)動(dòng)和變形，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。MAO等[16]在研究膽管癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ascin通過調(diào)控Wnt/β-Catenin信號(hào)通路可誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞EMT的轉(zhuǎn)化。本組研究表明，侵襲性垂體腺瘤組中Fascin蛋白的表達(dá)水平高于非侵襲組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且蛋白的表達(dá)水平和Knosp分級(jí)呈正相關(guān)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和相關(guān)文獻(xiàn)，作者認(rèn)為IPA中Fascin蛋白高表達(dá)，原因可能為侵襲性垂體腺瘤細(xì)胞中相關(guān)機(jī)制發(fā)揮作用，總結(jié)有以下幾點(diǎn)：(1)垂體腺瘤細(xì)胞侵襲周圍組織需要細(xì)胞膜上產(chǎn)生密集的侵襲性絲狀偽足以及其細(xì)胞骨架的重組，F(xiàn)ascin蛋白是絲狀偽足中主要的肌動(dòng)蛋白交聯(lián)體，F(xiàn)ascin蛋白聚集在細(xì)胞膜表面形成平行的肌動(dòng)蛋白束，組成和穩(wěn)定細(xì)胞骨架[17-18]。(2)最新研究發(fā)現(xiàn)[19-20]Stat3/ NF-kB介導(dǎo)的信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)Fascin的表達(dá)在乳腺癌中，并促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究證實(shí) IL-6 是激活 Jak/Stat3信號(hào)通路的主要因子，可以使 Fascin 蛋白的表達(dá)水平增高，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移。Fascin 蛋白又能進(jìn)一步誘導(dǎo)EMT 的發(fā)生，而且作者發(fā)現(xiàn)IL-6R/Stat3 信號(hào)通路與垂體裸細(xì)胞瘤侵襲性相關(guān)[21]，所以我們推測(cè)Fascin蛋白是通過誘導(dǎo)EMT來促進(jìn)腫瘤的侵襲。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，在垂體腫瘤組織切片的血管壁上，均可見Fascin蛋白的高表達(dá)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，孔霞等[22]在研究鼻咽癌時(shí)發(fā)現(xiàn)Fascin-1蛋白表達(dá)的趨勢(shì)分別與Rg3對(duì)血管生成擬態(tài)和遷移能力的變化趨勢(shì)呈正相關(guān)，考慮Fascin蛋白可能在腫瘤組織和血管擬態(tài)生成方面存在一定的相關(guān)性。綜上所述，F(xiàn)ascin蛋白可能是預(yù)測(cè)垂體腺瘤侵襲性的潛在生物學(xué)標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)。

腫瘤細(xì)胞的高增殖特性是其侵襲的關(guān)鍵步驟之一，當(dāng)其在一個(gè)封閉的微環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，最初可能是非侵襲性的，隨著腫瘤細(xì)胞數(shù)目的不斷增殖，并且處于一個(gè)高增殖水平狀態(tài)，體積不斷增大，壓縮周圍的細(xì)胞外基質(zhì)，這使得腫瘤組織內(nèi)空間越來越小，壓力越來越來高，導(dǎo)致了腫瘤向周圍組織侵襲性生長(zhǎng)。研究表明[23]細(xì)胞數(shù)目的擴(kuò)增和凋亡是其自身調(diào)控其細(xì)胞多少的一個(gè)重要平衡機(jī)制，當(dāng)腫瘤細(xì)胞有較高的增殖活性時(shí)，就提示了處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞比例處于高水平狀態(tài)，持續(xù)的增殖在臨床上表現(xiàn)為腺瘤快速增長(zhǎng)，以及術(shù)后殘余腫瘤易迅速?gòu)?fù)發(fā)[24]。Ki-67是一種與DNA結(jié)合的核內(nèi)蛋白，屬于IgG1家族，是Scholzen等人于1983年研究淋巴瘤細(xì)胞系時(shí)發(fā)現(xiàn)的，定位于人類第10號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，位于細(xì)胞核仁區(qū)，開始表達(dá)于細(xì)胞周期的G1期，在S期和G2期表達(dá)水平上升，至M期到達(dá)高峰，在細(xì)胞有絲分裂終末期迅速降解[25-26]。它可以識(shí)別G1晚期、S期和G2/M期胞核中的抗原，因其半衰期較短，只在細(xì)胞增殖各期表達(dá)，處于增殖過程中的腫瘤胞核和染色體均可以被標(biāo)記，不易受生長(zhǎng)因子等其他因素影響，所以能夠較好的判斷腫瘤的生長(zhǎng)增殖特性[27]。既往研究的證據(jù)充分表明較高的Ki-67標(biāo)記指數(shù)和垂體腺瘤的侵襲性相關(guān)，ALIREZA等[28]研究11例侵襲性垂體腺瘤Ki-67的表達(dá)，其中10例患者的Ki-67 LI>3%，曹學(xué)霞等人[29]的研究表明Ki-67 LI對(duì)預(yù)測(cè)垂體腺瘤患者的預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義,于澤奇等人[30]研究表明，Ki-67蛋白的表達(dá)和顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且蛋白表達(dá)水平和腫瘤病理級(jí)別呈正相關(guān)。本研究中，Ki-67的表達(dá)在兩組之間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且蛋白的表達(dá)和Knosp分級(jí)呈正相關(guān)，因此，Ki-67蛋白可能是預(yù)測(cè)腫瘤侵襲性的指標(biāo)之一。

研究結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)ascin、Ki-67蛋白在垂體腺瘤中的表達(dá)水平和年齡、性別、腫瘤大小、激素類別無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，2組中Fascin、Ki-67蛋白的表達(dá)水平相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且表達(dá)水平和影像學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)性(P<0.01)，王紅云等[31]人既往研究212例垂體腺瘤(侵襲性97例，非侵襲性115例)，結(jié)果表明Fascin蛋白的表達(dá)和垂體腺瘤是否侵襲呈密切相關(guān)，是預(yù)測(cè)垂體腺瘤復(fù)發(fā)的候選基因。本研究結(jié)果與其相符，提示Fascin、Ki-67可以作為判斷垂體腺瘤有無(wú)侵襲性的潛在生物學(xué)指標(biāo)，并可能為未來臨床應(yīng)用Fascin相關(guān)分子抑制劑治療侵襲性垂體腺瘤提供研究方向。

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