鄭文慧 秦澤明 李昕 曹馨月 單曉宇 溫紅玲 王志玉 黃濤 趙麗

250012濟(jì)南,山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)學(xué)系山東省“十三五”高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 感染性疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(鄭文慧、李昕、曹馨月、單曉宇、溫紅玲、王志玉、趙麗)；250012濟(jì)南,山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心(秦澤明)；250014濟(jì)南,山東省疾病預(yù)防控制中心(黃濤)

HIV相關(guān)腦病(HIV-associated dementia,HAD)是艾滋病患者晚期出現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,患者血腦屏障(blood brain barrier,BBB)出現(xiàn)不同程度的結(jié)構(gòu)損傷和功能減退,但其機(jī)制尚未闡釋清楚。HIV-1 Tat是HIV-1基因編碼的重要調(diào)控蛋白,可借助被HIV-1感染的巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌、釋放到細(xì)胞外,借助自身的穿膜功能到達(dá)機(jī)體多個部位。內(nèi)皮細(xì)胞是組成BBB的重要細(xì)胞,其活性對BBB功能尤為重要,本研究表達(dá)并純化了HAD患者大腦基底核來源的Tat蛋白,研究了其對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)活性的影響,以期為HIV-1神經(jīng)致病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

HAD患者基底核(basal ganglia,BG)來源的HIV-1基因(pGEX-KG-tat,216 bp)由本室克隆并保存。鎳親和層析柱、凝膠過濾預(yù)裝柱(Column Superdex 75 Increase 10/300 GL)和蛋白純化儀(AKTA explorer)為GE公司產(chǎn)品,His-Tag抗體為proteintech公司產(chǎn)品,BCA蛋白濃度測定試劑盒為碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,cck-8為biosharp公司產(chǎn)品,酶標(biāo)儀(Synergy2)為美國BioTek公司產(chǎn)品,HUVECs為本室保存。

PCR產(chǎn)物純化后和pET-32a載體酶切用T4連接酶22℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5-α,用氨芐青霉素篩選,陽性菌落送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.2 Tat蛋白的原核表達(dá)及鑒定：構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET-32a-tat轉(zhuǎn)化BL21(DE3),挑取單菌落接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)至吸光度值在0.6～0.8之間,用IPTG 37℃進(jìn)行誘導(dǎo)。菌液用PBS清洗,3次后用Tris-NaCl(Tris濃度為50 mmol/L,NaCl濃度為300 mmol/L,PH=8.0)重懸,冰上超聲破碎并離心,上清和沉淀經(jīng)Western blot(WB)鑒定,同時設(shè)pET-32a質(zhì)粒對照和細(xì)菌對照。

1.2.3 Tat蛋白的純化、鑒定及定量：冰上超聲破碎,4℃,9 000×離心30 min收集上清,蛋白純化儀進(jìn)行純化。按照產(chǎn)品說明書處理鎳親和層析柱后上樣,用含 10 mmol/L、200 mmol/L、500 mmol/L 咪唑的Tris-NaCl溶液洗脫,根據(jù)吸收峰的位置,收集洗脫液并經(jīng)SDS-PAGE和WB鑒定。蛋白純度高的洗脫液經(jīng)超濾離心管濃縮,再經(jīng)Column Superdex 75 Increase 10/300 GL進(jìn)一步純化,洗脫液為含1 mmol/L EDTA的Tris-NaCl,SDS-PAGE和WB進(jìn)行鑒定,濃縮后BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。

1.2.4 Tat蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響：HUVECs常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞鋪滿至90%時,將Tat蛋白加入96 孔板中,濃度依次為 100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、1 000 ng/ml,每個濃度設(shè)5個平行孔,以正常細(xì)胞為陰性對照,培養(yǎng)基作為空白對照。36 h后,按cck-8產(chǎn)品說明書操作檢測細(xì)胞活性,酶標(biāo)儀450 nm檢測吸光度()。

2 結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,在250 bp處出現(xiàn)與預(yù)計的第一外顯子基因(216 bp)片段大小相符的條帶。重組質(zhì)粒pET-32a-tat轉(zhuǎn)化后的陽性菌經(jīng)PCR鑒定和測序證實(shí)為HIV-1基因。

WB結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒 pET-32a-tat轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在相對分子質(zhì)量15×10處有一條明顯蛋白條帶(見圖1箭頭所示),與目的蛋白大小一致,還有小部分蛋白以多聚體存在,大部分可溶性蛋白在上清中,還有較少部分在包涵體內(nèi)。上清經(jīng)鎳親和層析柱純化,500 mmol/L洗脫液中Tat蛋白含量較高,加入DTT后對蛋白多聚體影響較小(見圖2所示)。該峰洗脫液濃縮后經(jīng)Column Superdex 75 Increase 10/300 GL進(jìn)一步純化可見單個吸收峰,根據(jù)出峰位置可知為一分子量較大的多聚體,純化濃縮后的Tat蛋白在DTT作用下,分解成以單體為主的多種形式(見圖3)。該單峰洗脫液濃縮,測得濃度為0.47 mg/ml。

HUVECs吸光度檢測結(jié)果及統(tǒng)計學(xué)分析見表1和表2。結(jié)果顯示,不同濃度Tat蛋白的實(shí)驗(yàn)組中,HUVECs細(xì)胞的均數(shù)在組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)；陰性對照組(0 ng/ml)、100 ng/ml和200 ng/ml實(shí)驗(yàn)組之間均數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)；與陰性對照組相比,300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml和1 000 ng/ml組顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml和1 000 ng/ml組之間值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(=19.607,=0.000)。隨著Tat蛋白濃度的增加,細(xì)胞活性逐漸降低,300 ng/ml組細(xì)胞活性下降更明顯(圖4)。

圖1 HIV-1 Tat的表達(dá)與鑒定A： SDS-PAGE；B：Western blotM：Protein marker；1：Bacterium control；2：pET-32a plasmid control；3：pET-32a-tat positive bacterium；4：Supernatant；5：PrecipitationFig.1 Expression and identification of HIV-1 Tat

3 討論

圖2 HIV-1 Tat經(jīng)鎳親和層析柱純化和鑒定A：UV absorption of AKTA explorer；B：SDS-PAGE；C：Western blotM：protein marker；1：Waste liquor；2：Waste liquor with DTT；3：200 mmol/L imidazole eluent；4：200 mmol/L imidazole eluent with DTT；5：500 mmol/L imidazole eluent；6：500 mmol/L imidazole eluent with DTTFig.2 Purification of HIV-1 Tat protein by Ni-chelating chromatography column and identification

表1 不同濃度HUVECs細(xì)胞吸光度檢測結(jié)果Tab.1 Absorbance of HUVECs in different concentration groups

表2 不同組HUVECs吸光度多重比較方法的結(jié)果Tab.2 Absorbance of HUVECs in different groups results of multiple comparisons

Tat蛋白由調(diào)控基因tat的兩個獨(dú)立外顯子編碼,可劃分為N末端激活區(qū)、半胱氨酸富集區(qū)、核心區(qū)、堿性氨基酸富集區(qū)、谷氨酰胺富集區(qū)、C-末端區(qū)六個功能區(qū)。Tat蛋白對BBB相關(guān)細(xì)胞的作用方式可分為兩種：①直接作用：Tat可與細(xì)胞表面受體結(jié)合,發(fā)揮生物學(xué)作用,如堿性氨基酸富集區(qū)可介導(dǎo)Tat蛋白與硫酸類肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPG)結(jié)合,使Tat蛋白在細(xì)胞外基質(zhì)富集,Tat蛋白與堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)競爭結(jié)合 HSPG,使bFGF濃度增加,從而促進(jìn)卡波氏肉瘤和內(nèi)皮細(xì)胞增長；也可借助堿性氨基酸富集區(qū)的穿膜特性進(jìn)入細(xì)胞,可調(diào)控HIV-1基因組表達(dá),并為病毒復(fù)制創(chuàng)造適宜環(huán)境。還可通過損傷細(xì)胞器、上調(diào)促凋亡蛋白表達(dá)等途徑損傷細(xì)胞,影響細(xì)胞發(fā)揮正常生理作用。②間接作用：通過激活信號通路等途徑,誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生ROS和促炎癥介質(zhì),參與炎癥反應(yīng),進(jìn)而損傷BBB。近些年的研究表明,HIV-1 Tat蛋白可通過損傷BBB相關(guān)細(xì)胞、調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)等途徑損傷BBB的結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響B(tài)BB發(fā)揮正常功能。

A：AKTA explorer UV 吸收圖；B：SDS-PAGE；C：Western blot；圖3 Column Superdex 75 Increase 10/300 GL純化的HIV-1 Tat及鑒定A：UV absorption of AKTA explorer；B：SDS-PAGE；C：Western blot；Fig.3 Purification of HIV-1 Tat by Column Superdex 75 Increase 10/300 GL and determination

?與陰性對照組比較,P＜0.05圖4 HIV-1 Tat蛋白對HUVECs細(xì)胞活性的影響?P＜0.05 VS negative controlFig.4 The effects of HIV-1 Tat on viability of HUVECs

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),該HAD患者感染的HIV-1為B亞型,其BG來源tat序列與HXB2 tat標(biāo)準(zhǔn)序列間的基因距離差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),而非HAD患者BG來源tat序列與HXB2 tat標(biāo)準(zhǔn)序列間的基因距離差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05),HAD患者BG來源的Tat誘導(dǎo)U87細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-1β比非HAD患者BG來源組高,表明二者生物學(xué)活性存在差異。本研究表達(dá)了HAD患者BG來源的HIV-1 Tat,并進(jìn)行純化,研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)鎳親和層析柱純化的Tat蛋白在濃度較低時主要是以單體和二聚體存在,蛋白濃縮后經(jīng)凝膠過濾預(yù)裝柱進(jìn)一步純化后,得到的UV吸收峰為單峰。在DTT的作用下,多聚體逐漸分解成以單體為主、多種聚合體共同存在,說明Tat多聚體的形成并不完全依靠二硫鍵,其他機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

HIV-1進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)首先要通過血腦屏障,血腦屏障維持腦內(nèi)各種離子、遞質(zhì)等的動態(tài)平衡與BBB的細(xì)胞和結(jié)構(gòu)密不可分。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障最表面的細(xì)胞,對維持血腦屏障的通透性具有非常重要的作用,同時,內(nèi)皮細(xì)胞之間形成的緊密連接還可控制細(xì)胞旁路的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。HIV-1感染細(xì)胞后,在細(xì)胞內(nèi)增殖,合成病毒蛋白,通過直接感染內(nèi)皮細(xì)胞和破壞緊密連接蛋白損傷血腦屏障。血腦屏障的通透性增強(qiáng),感染了HIV-1的單核細(xì)胞等有害物質(zhì)可進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng),損傷神經(jīng)元,進(jìn)而引起一系列的神經(jīng)行為障礙?；趦?nèi)皮細(xì)胞在HIV入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)和HIV神經(jīng)致病性過程中的重要地位,本文使用內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行研究。先前研究血管內(nèi)皮細(xì)胞通常采用原代HUVECs,但其增殖能力低且生命周期有限,本研究采用的HUVECs可穩(wěn)定傳代,生長良好,易于培養(yǎng),且保留了原代內(nèi)皮細(xì)胞的特征,可較好的替代原代內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行研究。不同濃度的Tat蛋白對HUVECs活性的影響結(jié)果顯示,與陰性對照組相比,100 ng/ml和200 ng/ml Tat使HUVECs細(xì)胞活性降低,但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義；隨著Tat蛋白濃度的增加,細(xì)胞活性逐漸降低,300 ng/ml組細(xì)胞活性下降明顯。與陰性對照組相比,300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml和 1 000 ng/ml四組細(xì)胞活性差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,但是組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。不同Tat濃度對HBMECs活性影響的結(jié)果可能與 Tat蛋白的作用方式有關(guān),Tat對HUVECs的作用是通過與其表面受體的結(jié)合還是進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用有待于進(jìn)一步研究。Ma等報道,200 ng/ml Tat蛋白可使人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human brain microvascular endothelial cells,HBMECs)活性顯著降低,與本研究的結(jié)果略有不同,原因之一可能是HUVECs與HBMECs都有內(nèi)皮細(xì)胞的共性,但在結(jié)構(gòu)和功能仍存在差異,使得不同的內(nèi)皮細(xì)胞對外源性物質(zhì)的敏感性存在差異。此外,不同亞型的HIV-1 Tat蛋白在與 LTR(long terminal repeat sequence,LTR)結(jié)合能力、促進(jìn)病毒增殖和上調(diào)細(xì)胞因子、趨化因子輔助受體表達(dá)等生物學(xué)活性方面存在差異,Tat蛋白的氨基酸位點(diǎn)的變異使其功能和致病機(jī)制發(fā)生轉(zhuǎn)變,不同來源的Tat,其氨基酸位點(diǎn)變異不同,這也可能是造成研究結(jié)果差異的原因。

本研究優(yōu)化了Tat蛋白的純化條件、且純化的蛋白具有一定的生物學(xué)活性,為進(jìn)一步研究細(xì)胞水平和動物水平Tat蛋白的神經(jīng)致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

無