任萬平 邵 偉,2 雒誠龍 余 雄

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052；2.新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)重點(diǎn)實驗室,烏魯木齊 830052)

動物肌內(nèi)脂肪的含量和積累使肌肉表現(xiàn)出大理石花紋狀，影響和決定著肉的品質(zhì)，動物體內(nèi)脂肪的沉積最先是皮下脂肪沉積，再是內(nèi)臟脂肪沉積，最后才是肌間脂肪的沉積；這就要求實現(xiàn)對脂肪代謝的調(diào)控，最大可能地增加動物體內(nèi)脂肪的合成與沉積,才能實現(xiàn)脂肪在肌間的沉積。檸檬酸作為脂代謝中的關(guān)鍵產(chǎn)物，對脂肪的代謝起著重要的調(diào)控作用，高濃度的檸檬酸可活化檸檬酸裂解酶，產(chǎn)生大量的乙酰輔酶A，乙酰輔酶A和檸檬酸共同激活乙酰輔酶A羧化酶，促進(jìn)丙二酰輔酶A的合成，從而促進(jìn)脂肪酸的合成[1]。趙儉[2]研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸經(jīng)過檸檬酸裂解酶催化生成草酰乙酸和乙酰輔酶A,它們對真菌生物脂肪積累具有重要調(diào)節(jié)作用。楊文洲等[3]研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸能

夠促進(jìn)酵母菌體內(nèi)三羧酸循環(huán)，而三羧酸循環(huán)直接影響脂代謝。田靜[4]研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸合成酶基因與牛肉脂肪性狀、含量、分布和品質(zhì)顯著相關(guān)。國內(nèi)針對檸檬酸對脂肪細(xì)胞脂肪代謝的影響尚未見報道，檸檬酸對脂肪代謝影響和調(diào)控機(jī)制有待深入研究。本試驗通過研究不同劑量的檸檬酸對小鼠脂肪代謝的影響，以期促進(jìn)脂肪的合成與沉積，并在細(xì)胞分子水平上利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的雙抗夾心法檢測脂肪在合成和分解代謝中生成的關(guān)鍵限速酶、代謝產(chǎn)物的含量，闡述檸檬酸對脂肪代謝調(diào)控的整體影響，探索其對脂肪代謝調(diào)控的機(jī)制，為實現(xiàn)調(diào)控脂肪代謝提供新的思路和理論依據(jù)，也為今后實現(xiàn)動物肌肉內(nèi)脂肪的沉積改善肉品品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗于2016年10月至2017年9月在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)肉乳用草食動物營養(yǎng)重點(diǎn)實驗室進(jìn)行。按照單因素試驗設(shè)計，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同劑量的檸檬酸作為不同組，試驗組檸檬酸劑量分別為20 (試驗Ⅰ組)、50(試驗Ⅱ組)、200 μmol/L(試驗Ⅲ組)，對照組(CK組)不添加檸檬酸，在0、36和72 h收集細(xì)胞凍存、以備送檢；每組3個平行樣，每個平行樣3次重復(fù)。

1.2 試驗材料

小鼠前脂細(xì)胞(3T3-L1細(xì)胞)購于上海賽笠生物技術(shù)公司；檸檬酸、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青-鏈霉素試劑、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松(DEX)、胰島素(INS)均購于美國GIBCO公司；試驗所用ELISA試劑盒均由上海美軒生物技術(shù)公司生產(chǎn)。

1.3 試驗方法

1.3.1 試劑配制

完全培養(yǎng)基組成為89% DMEM高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清(FBS)、1%青-鏈霉液；誘導(dǎo)液Ⅰ由完全培養(yǎng)基添加0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L DEX、5 mg/L INS組成；誘導(dǎo)液Ⅱ由完全培養(yǎng)基添加5 mg/L INS組成。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

參照郭秀玲等[5]方法。將小鼠前脂細(xì)胞放入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右，將細(xì)胞傳代接種到培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)，融合度達(dá)80%時誘導(dǎo)，先用誘導(dǎo)液Ⅰ培養(yǎng)2 d,再換誘導(dǎo)液Ⅱ培養(yǎng)2 d,更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的第14天,按試驗設(shè)計劑量加入含檸檬酸完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，于0、36、72 h收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.3.3 細(xì)胞形態(tài)觀察

細(xì)胞經(jīng)過油紅O染色，采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4 代謝產(chǎn)物和酶含量的測定

試驗中各種代謝產(chǎn)物和酶含量的測定均參照閆莉等[6]的雙抗夾心法。試驗收集的細(xì)胞凍存后送由上海賽笠生物技術(shù)公司檢測。

1.4 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)用平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 檸檬酸對小鼠脂肪細(xì)胞脂滴形態(tài)的影響

不同檸檬酸水平下小鼠脂肪細(xì)胞脂滴形態(tài)見圖1。

a：對照組 CK group；b：試驗Ⅰ組 test group Ⅰ；c：試驗Ⅱ組 test group Ⅱ；d：試驗Ⅲ組 test group Ⅱ。

圖1檸檬酸對小鼠脂肪細(xì)胞脂滴形態(tài)的影響(72h，油紅O染色)

Fig.1 Effects of citric acid on lipid droplet morphology of mouse adipocytes (72 hours, oil red O staining, 400×)

2.2 檸檬酸對小鼠脂肪細(xì)胞TG合成代謝中關(guān)鍵限速酶含量的影響

由表1可知，在36和72 h時，試驗Ⅰ組醛縮酶(FDA)含量均顯著高于對照組(P<0.05)，試驗Ⅱ和Ⅲ組FDA含量均極顯著高于對照組(P<0.01)；各試驗組果糖-6-磷酸激酶(6-PFK)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、丙酮酸脫氫酶E1(PDHE1)、二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙?；?DLAT)、甘油二酯轉(zhuǎn)?；?(DGAT2)含量與對照組在0、36、72 h差異均不顯著(P>0.05)；在36和72 h時，各試驗組二氫硫辛酰胺脫氫酶(DLD)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)含量均極顯著高于對照組(P<0.01)。

表1 檸檬酸對小鼠脂肪細(xì)胞TG合成中關(guān)鍵限速酶含量的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same column, values with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01)， and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05)， while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.3 檸檬酸對小鼠脂肪細(xì)胞甘油三酯(TG)分解代謝中關(guān)鍵限速酶含量的影響

由表2可知，在36和72 h時，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組激素敏感脂肪酶(HSL)含量均極顯著低于對照組(P<0.01)，各試驗組間差異不顯著(P>0.05)；在0、36和72 h時，各試驗組甘油三酯水解酶(TGH)含量與對照組差異均不顯著(P>0.05)；在0 h時，各試驗組肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)含量與對照組差異不顯著(P>0.05)，在36和72 h時，各試驗組CPT1含量均極顯著低于對照組(P<0.01)，各試驗組間差異不顯著(P>0.05)。

表2 檸檬酸對小鼠脂肪細(xì)胞TG分解代謝中關(guān)鍵限速酶含量的影響

2.4 檸檬酸對小鼠脂肪細(xì)胞TG代謝產(chǎn)物含量的影響

由表3可知，在0 h時，各試驗組TG含量與對照組差異均不顯著(P>0.05)，在36和72 h時，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組TG含量均顯著高于對照組(P<0.05)；各試驗組甘油二酯(DG)含量在各時間點(diǎn)與對照組相比差異均不顯著(P>0.05)；在36和72h時，各試驗組游離脂肪酸(FFA)含量均極顯著低于對照組(P<0.01),各試驗組間差異不顯著(P>0.05)；在0 h時，各試驗組丙酮酸(PA)含量與對照組差異不顯著(P>0.05)，在36和72 h時，各試驗組丙酮酸(PA)含量均顯著高于對照組(P<0.05)；在36和72 h時，各試驗組乙酰輔酶A含量均極顯著低于對照組(P<0.01),各試驗組差異不顯著(P>0.05)。

表3 檸檬酸對小鼠脂肪細(xì)胞TG代謝產(chǎn)物含量的影響

續(xù)表3項目Items組別Groups時間Time/h03672游離脂肪酸FFA/(μg/mL)對照CK100.76±7.7997.67±7.79Aa95.59±8.01AaⅠ96.72±7.2165.32±6.35Bb65.71±6.13BbⅡ99.36±7.1661.86±6.02Bb68.11±6.24BbⅢ101.72±7.2466.09±5.23Bb69.98±5.55Bb丙酮酸PA/(nmol/mL)對照CK9.18±0.879.39±0.77b9.49±0.84bⅠ9.59±0.8210.26±0.71a10.80±0.79aⅡ9.78±0.7910.60±0.69a11.14±0.65aⅢ9.29±0.8510.77±0.73a11.19±0.78a乙酰輔酶AAcetyl-CoA/(pg/mL)對照CK926.03±35.01899.61±32.13Aa893.53±31.74AaⅠ939.46±33.94641.45±34.75Bb639.18±29.37BbⅡ943.46±34.89686.24±30.87Bb651.38±28.62BbⅢ944.45±30.64645.85±30.26Bb626.78±27.88Bb

3 討 論

3.1 檸檬酸對小鼠脂肪細(xì)胞TG合成關(guān)鍵限速酶含量的影響

6-PFK、G6PD和FDA是脂代謝過程糖酵解的關(guān)鍵限速酶，能夠催化葡糖糖向丙酮酸的代謝。本試驗中，添加不同劑量的檸檬酸各試驗組的6-PFK和G6PD含量均高于對照組，但差異不顯著，在36和72 h時，試驗Ⅰ組的FDA含量在均顯著高于對照組，試驗Ⅱ和Ⅲ組均極顯著高于對照組。而Khu等[7]研究發(fā)現(xiàn)糖代謝中G6PD和FDA的含量升高能夠促進(jìn)細(xì)胞對糖的利用增加脂肪的合成和沉積，門麗媛等[8]研究也證實FDA的表達(dá)量升高能夠顯著提高TG的合成和沉積，這與本試驗結(jié)果一致，說明添加不同劑量的檸檬酸能夠促進(jìn)小鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)糖的酵解，為合成TG提供更多的原料，而各試驗組PA的含量均顯著高于對照組也能證明這一點(diǎn)。

PDHE1、DLAT、DLD統(tǒng)稱為丙酮酸脫氫酶復(fù)合體，是丙酮酸進(jìn)入線粒體脫羧生成生脂原料乙酰輔酶A的關(guān)鍵酶系，DLAT和DLD在該酶系中起到主要調(diào)節(jié)作用，二者共同作用使該酶系復(fù)合物磷酸化和去磷酸化而調(diào)節(jié)其活性。本試驗中，添加不同劑量檸檬酸對PDHE1和DLAT含量影響不大，在36和72 h時，各試驗組DLD的含量極顯著提高。程鈺蓉等[9]研究發(fā)現(xiàn)，丙酮酸脫氫酶系活性增加脂肪合成增強(qiáng)，其活性抑制能夠降低脂肪的合成。與本試驗結(jié)果相似，這說明添加不同劑量的檸檬酸能夠提高細(xì)胞中丙酮酸脫氫酶系的活性，從而促進(jìn)丙酮酸的代謝，為合成TG提供更多的乙酰輔酶A等原料。

ACC是細(xì)胞內(nèi)以乙酰輔酶A為原料合成脂肪酸的重要限速酶，檸檬酸是其激活劑，能夠催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A，進(jìn)而合成脂肪。本試驗中，添加不同劑量的檸檬酸各試驗組能夠極顯著提高ACC的含量，且各試驗組之間差異不顯著。Mao等[10]和Barber等[11]研究證實，ACC活性增加能夠促進(jìn)細(xì)胞TG的合成與沉積，這與本試驗結(jié)果一致。

FAS是一個多酶復(fù)合體，在脂肪酸從頭合成中起催化作用。本試驗結(jié)果表明，添加不同劑量檸檬酸能夠極顯著提高FAS的含量，且各試驗組之間差異不顯著。Dentin等[12]研究證實FAS活性的高低直接控制脂肪合成的強(qiáng)弱，其基因表達(dá)水平升高能夠顯著增加TG的沉積，充分證明本試驗結(jié)果。

3.2 檸檬酸對小鼠脂肪細(xì)胞TG分解關(guān)鍵限速酶含量的影響

TG的存在是一個合成和分解動態(tài)平衡的結(jié)果，其在合成的同時分解也在進(jìn)行。HSL在脂肪分解中起到?jīng)Q定性作用，是分解脂肪的最關(guān)鍵的限速酶。本試驗中，添加不同劑量檸檬酸的各試驗組HSL的含量均極顯著低于對照組，且各試驗組之間差異不顯著。這與Lorente-Cebrián等[13]與Chong等[14]研究結(jié)果一致，說明檸檬酸能夠極顯著降低HSL含量和活性，從而抑制TG在胞內(nèi)的分解。

TGH存在細(xì)胞質(zhì)、脂滴和細(xì)胞膜上，是催化TG水解的重要脂肪酶。Cornaciu等[15]、Chakrabarti等[16]和Serr等[17]研究發(fā)現(xiàn)TGH的表達(dá)抑制能夠促進(jìn)TG的沉積，袁禹惠[18]研究發(fā)現(xiàn)，高脂營養(yǎng)水平能夠抑制脂肪的沉積，但是對TGH的表達(dá)和TGH含量影響并不顯著，與本試驗結(jié)果一致。這表明添加檸檬酸對TGH含量影響不顯著,說明本試驗中檸檬酸主要是通過抑制HSL合成從而抑制了TG的分解，從而增加了TG在胞內(nèi)的沉積。

CPT1是轉(zhuǎn)運(yùn)活化的脂肪酸(脂酰輔酶A)進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化分解的關(guān)鍵限速酶。本試驗結(jié)果表明，添加檸檬酸的各試驗組CPT1的含量均在36和72 h時均極顯著低于對照組,各試驗組之間差異均不顯著。董婧[19]、Abu-Elheiga等[20]研究證實抑制CPT1的表達(dá)和CPT1合成能夠抑制脂肪的氧化，增加脂肪的沉積。與本試驗結(jié)果一致。這說明檸檬酸能夠抑制脂肪細(xì)胞內(nèi)CPT1的含量，抑制脂肪酸的β氧化分解，從而增加了TG在脂肪細(xì)胞內(nèi)的沉積。

3.3 檸檬酸對小鼠脂肪細(xì)胞TG代謝產(chǎn)物含量的影響

本試驗中，添加檸檬酸各試驗組TG的含量在36和72 h時均顯著高于對照組，各試驗組之間差異不顯著，說明一定劑量的檸檬酸能夠促進(jìn)小鼠脂肪細(xì)胞TG的合成和沉積，且20 μmol/L為最佳。這是因為在脂肪酸合成過程中，首先，檸檬酸能夠作為激活劑催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A,而生成的丙二酰輔酶A越多，細(xì)胞合成的脂肪酸和TG也就越多；其次，檸檬酸參與檸檬酸-丙酮酸循環(huán)，葡萄糖分解產(chǎn)生的丙酮酸進(jìn)入線粒體經(jīng)一系列酶催化生成乙酰輔酶A與檸檬酸結(jié)合通過線粒體膜進(jìn)入胞液內(nèi)，用于合成脂肪酸進(jìn)而合成TG；再次，檸檬酸作為糖代謝關(guān)鍵中間產(chǎn)物，其本身經(jīng)過一系列酶的催化可以生成用于合成脂肪酸的原料乙酰輔酶A。童晉[21]研究結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)檸檬酸合成酶與檸檬酸含量表達(dá)上升能夠增加脂肪酸和脂肪的合成增加，與本試驗結(jié)果類似。

DG和FFA既是TG的合成前體同時也是其分解產(chǎn)物，在本試驗中添加不同濃度檸檬酸的各試驗組FFA的含量均極顯著低于對照組，這與楊竹青等[22]通過煙酸抑制TG分解從而顯著降低細(xì)胞中FFA含量結(jié)果一致，因為添加檸檬酸能夠顯著降低TG水解酶HSL的含量，所以FFA的含量顯著降低。

PA作為脂代謝的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，和檸檬酸構(gòu)成檸檬酸-丙酮酸循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)合成脂肪的原料乙酰輔酶A，在本試驗中各試驗組PA的含量均高于對照組。Wang等[23]研究發(fā)現(xiàn)在脂代謝的調(diào)控過程，多余的葡萄糖會誘導(dǎo)葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、ACC及FAS等表達(dá)，從而促進(jìn)脂肪的合成。

乙酰輔酶A是脂代謝最關(guān)鍵的中間產(chǎn)物，由糖分解代謝產(chǎn)生用于脂肪的合成代謝。本試驗中各試驗組的乙酰輔酶A的含量均極顯著低于對照組，但是本試驗結(jié)果顯示添加檸檬酸能夠促進(jìn)丙酮酸脫氫酶系中DLAT、DLD的含量，促進(jìn)丙酮酸的代謝生成更多的乙酰輔酶A,分析原因是因為添加了檸檬酸更好的激活了ACC的作用，使糖酵解生成的乙酰輔酶A更多用于合成脂肪。王倩倩等[24]研究發(fā)現(xiàn)，ACC表達(dá)上升能夠顯著促進(jìn)鵝脂肪細(xì)胞中TG的合成，同時降低脂肪合成原料乙酰輔酶A在細(xì)胞的內(nèi)的含量，與本試驗結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

① 檸檬酸能夠促進(jìn)小鼠脂肪細(xì)胞TG的合成,抑制TG的分解，增加小鼠脂肪中脂肪含量和沉積，添加20 μmol/L檸檬酸最佳。

② 檸檬酸能夠顯著或極顯著提高合成TG合成代謝中的關(guān)鍵限速酶FDA、ACC、FAS的含量，能夠極顯著抑制TG分解代謝中關(guān)鍵限速酶HSL、CPT1的含量。

③ 檸檬酸能夠顯著提高TG代謝的中間產(chǎn)物PA含量，能夠極顯著降低FFA和乙酰輔酶A的含量。

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