陳家順 康寶聚 曾建國 胡海波 趙玉蓉 陳 柳 姚 康* 符晨星,*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，長沙 410125；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙 410128；4.湖南美可達生物資源有限公司,長沙 410128；5.瀏陽市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，瀏陽 410300)

在現(xiàn)代生豬生產(chǎn)中，為了提高母豬繁殖效率，降低母子間疾病傳播幾率等，早期斷奶早已被采用。然而由于生理、營養(yǎng)和環(huán)境的突然改變，導(dǎo)致斷奶仔豬采食量下降、腸道疾病頻發(fā)、生長阻滯、死亡率提高，通常稱之為斷奶應(yīng)激綜合征[1]。盡管在斷奶仔豬飼糧中添加抗生素能在一定程度上提高動物的生長性能和抗病能力，緩解斷奶應(yīng)激綜合征[2]，但是抗生素類飼料添加劑的大量使用，甚至濫用，導(dǎo)致畜禽胃腸道內(nèi)的細菌耐藥性大幅提高，動物體內(nèi)殘留和環(huán)境污染等問題日漸加劇，從而影響動物源性的食品安全，并直接影響人類健康和環(huán)境安全[3-4]。因此，迫切需要開發(fā)新的無藥物殘留、無污染、無抗藥性的綠色抗生素用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)。血根堿是從博落回中分離出來的苯菲啶異喹啉類生物堿，具有使用后易降解，對環(huán)境污染小的優(yōu)勢，其成分特殊，作用機理獨特[5-6]。血根堿及其衍生物具有較強的細胞滲透性，對一些病原菌，如沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等具有較強抑制作用[7]。血根堿還具有抗腫瘤[8-10]、增強免疫力[11]、抗炎[12]、抗氧化[13]等多種藥理作用，由此可見，血根堿以其特有的藥理學(xué)特性，具有開發(fā)成新型綠色飼料添加劑的潛力。隨著血根堿在人類臨床中的廣泛應(yīng)用，其在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用也備受關(guān)注。Kosina等[13]研究表明，在28日齡斷奶仔豬飼料中添加含3.75 mg/kg血根堿的博落回生物堿，能夠刺激仔豬食欲來增加采食量，保護腸道內(nèi)必需氨基酸的降解，進而促進動物生長。Lee等[14]和劉靖[15]研究表明，肉雞飼糧中血根堿與有機酸聯(lián)用能夠改善腸道結(jié)構(gòu)及腸道菌群平衡而達到促生長效果。云龍[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加血根堿能顯著提高黃羽肉雞血清免疫球蛋白M(IgM)含量，并改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進雞的生長性能。目前，有關(guān)血根堿在畜禽中促生長效果的原因還不是很明確，但都提到可能與改善腸道健康有關(guān)，而其對斷奶仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及免疫功能的影響研究尚未見報道。基于此，本試驗在斷奶仔豬飼糧中添加血根堿，探討其對斷奶仔豬生長性能、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及小腸黏膜免疫功能的影響，旨在為開發(fā)安全、高效、環(huán)保的無抗仔豬飼糧提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

血根堿制劑：血根堿有效濃度為1.5%，由湖南美可達生物資源有限公司提供；所用抗生素為金霉素，有效成分含量為15%，市售產(chǎn)品。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

試驗選取23日齡平均體重為(6.55±0.18) kg的健康“杜×長×白”三元雜交斷奶仔豬36頭，按體重相近、性別比例相同原則隨機分為3組，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對照組)、基礎(chǔ)飼糧+75 mg/kg 金霉素(抗生素組)、基礎(chǔ)飼糧+50 mg/kg血根堿(血根堿組)，每組12個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬，試驗期21 d。

1.3 試驗飼糧與飼養(yǎng)管理

試驗基礎(chǔ)飼糧按照NRC(2012)[17]飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。本試驗在中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動物樓飼養(yǎng)室進行，仔豬采用不銹鋼單籠飼養(yǎng)。每天對仔豬進行喂食3次，時間分別為07:30、12:00和18:30，自由采食和飲水，粉料飼喂，以食槽無剩料為原則。試驗期間每日準(zhǔn)確記錄每頭豬的實際采食量，觀察豬群的健康情況。室內(nèi)消毒、清掃按常規(guī)程序進行，并保持豬舍通風(fēng)、清潔。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of the diet：VA 10 800 IU，VD34 000 IU，VE 40 IU，VK33.4 mg，VB11.6 mg，VB212 mg，VB66 mg，VB120.05 mg，生物素 biotin 0.2 mg，葉酸 folic acid 2 mg，煙酸 niacin 50 mg，D-泛酸鈣D-calcium pantothenate 25 mg,Fe 80 mg，Cu 100 mg，Mn 50 mg，Zn 90 mg，Co 1 mg,Se 0.17 mg，I 0.15 mg。

2)營養(yǎng)水平為計算值。Nutrient levels were calculated values.

1.4 樣品采集

于試驗結(jié)束后，禁食12 h，所有試驗豬靜脈注射150.00 mg/kg BW戊巴比妥鈉，待其麻醉后，按常規(guī)程序進行屠宰，并采集小腸各段[包括十二指腸(距幽門約10 cm處)、空腸(小腸中段)及回腸(距回盲腸結(jié)遠端約5 cm處)]各2.5 cm，固定于10%中性甲醛溶液中，用于制作石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色以檢測腸道形態(tài)。各腸段剩余部分用剪刀輕輕剖開10 cm左右的十二指腸、空腸和回腸腸段，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕沖洗腸壁內(nèi)容物，并用濾紙吸干腸段表面的水分，而后用玻璃載玻片刮取腸黏膜，使用錫箔紙將樣品進行包裹，立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存待測。

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 生長性能

飼養(yǎng)試驗開始第1天早晨對每頭仔豬進行空腹稱重，為初始體重，飼養(yǎng)試驗結(jié)束后再次稱重，記錄仔豬的體重，并計算出每組仔豬的平均日增重(ADG)；記錄每頭仔豬每天的給料量和剩料量，計算每組仔豬的平均日采食量(ADFI)以及料重比(F/G)。計算公式如下：

ADG=(初始體重-終末體重)/試驗天數(shù)；ADFI=總采食量/試驗天數(shù)；F/G=ADFI/ADG。

每天08:00觀察斷奶仔豬糞便情況，記錄每組仔豬日腹瀉頭數(shù)及腹瀉天數(shù)，計算腹瀉率：

腹瀉率(%)=100×(每天腹瀉頭數(shù)×
腹瀉天數(shù))/(試驗豬頭數(shù)×試驗天數(shù))。

1.5.2 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)

取出10%甲醛溶液中固定的腸道組織，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色后，利用Motic Images Advanced 3.2軟件，測量十二指腸、空腸、回腸隱窩深度和絨毛高度，每張切片觀察10個視野，并計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)值[18]。

1.5.3 小腸黏膜免疫球蛋白含量

參考王斌星等[2]的方法，將十二指腸、空腸和回腸黏膜溶于2 mL PBS(pH=7.4)中，于3 500 ×g離心5 min，收集上清液。小腸黏膜免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和IgM含量均采用豬酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒測定，具體測定方法見ELISA Kit(南京森貝伽生物科技有限公司)說明書。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2013進行初步處理，用軟件SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，采用Duncan氏法進行多重比較和差異顯著性檢驗，腹瀉率采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。以P<0.01作為差異極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)，0.05≤P<0.10作為呈升高或降低趨勢的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 血根堿對斷奶仔豬生長性能的影響

由表2可知，與對照組相比，血根堿組和抗生素組的ADG和ADFI顯著提高(P<0.05)，F(xiàn)/G和腹瀉率顯著降低(P<0.05)；但血根堿組與抗生素組間以上生長性能指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)。由此推斷，飼糧中添加血根堿可以提高斷奶仔豬的生長性能，且效果與添加抗生素相當(dāng)。

2.2 血根堿對斷奶仔豬小腸形態(tài)的影響

由圖1和表3可知，與對照組相比，血根堿組和抗生素組的十二指腸絨毛高度、V/C值顯著升高(P<0.05)，空腸絨毛高度、V/C值極顯著升高(P<0.01)，但血根堿組和抗生素組間以上指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)；而血根堿組回腸絨毛高度、V/C值顯著高于其他2組(P<0.05)。由此推斷，飼糧中添加血根堿可以增加斷奶仔豬腸道黏膜表面積，從而提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率。

2.3 血根堿對斷奶仔豬小腸黏膜免疫球蛋白含量的影響

由表4可知，與對照組相比，血根堿組和抗生素組十二指腸黏膜IgA含量顯著升高(P<0.05)，IgM含量極顯著升高(P< 0.01)；空腸黏膜IgA和IgG含量顯著升高(P<0.05)；回腸黏膜IgG和IgM含量顯著升高(P<0.05)，IgA含量極顯著升高(P<0.01)。但血根堿組和抗生素組間以上指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)。由此推斷，飼糧中添加血根堿可以提高斷奶仔豬的腸道免疫功能。

表2 血根堿對斷奶仔豬生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

圖1 斷奶仔豬小腸形態(tài)學(xué)檢測

項目Items對照組Controlgroup抗生素組Antibioticgroup血根堿組SanguinarinegroupP值P-value絨毛高度Villusheight/μm十二指腸Duodenum509.31±13.49b554.27±31.21a589.56±19.68a0.015空腸Jejunum500.83±18.78Bb539.94±24.45Aa562.48±30.20Aa0.007回腸Ileum499.16±16.85b515.39±33.74b543.87±11.94a0.023隱窩深度Cryptdepth/μm十二指腸Duodenum307.55±16.33305.87±18.68300.21±25.570.421空腸Jejunum296.37±18.41287.49±17.56270.33±10.260.095回腸Ileum280.43±13.99271.58±19.27257.59±28.120.147絨毛高度/隱窩深度V/C十二指腸Duodenum1.66±0.09b1.81±0.11a1.96±0.12a0.038空腸Jejunum1.69±0.04Bb1.88±0.05Aa2.08±0.11Aa0.006回腸Ileum1.78±0.07b1.89±0.18b2.11±0.11a0.014

表4 血根堿對斷奶仔豬小腸黏膜免疫球蛋白含量的影響

3 討 論

血根堿是一種新型待開發(fā)的植物性生物堿，其作為一種飼料添加劑在動物營養(yǎng)和飼料中的應(yīng)用，主要是基于作為抗生素的替代物來進行的[19]。長期大量使用抗生素會引起病原菌耐藥性增強、腸道正常菌群結(jié)構(gòu)被破壞以及藥物殘留等一系列的問題，給人類健康造成潛在的威脅。大鼠的安全評估研究表明，高劑量的血根堿及其衍生物長期飼喂大鼠90 d，不引起機體損傷，且其原形物或代謝產(chǎn)物不在體內(nèi)殘留[20]。同時國內(nèi)外一些研究表明，血根堿在畜禽應(yīng)用中有顯著的促生長和降低腹瀉效果。饒華等[21]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加血根堿能顯著提高斷奶仔豬ADG和ADFI，降低腹瀉率和緩解仔豬斷奶應(yīng)激，同時與添加金霉素相比，ADG和ADFI差異不顯著。戴波[22]研究也發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加血根堿能夠降低斷奶仔豬腹瀉率。Kantas等[23]研究表明，飼糧中添加50 mg/kg血根堿能夠增加斷奶仔豬的體重和ADG。Vieira等[24]研究報道，在火雞飼糧中添加50 mg/kg血根堿，提高了火雞的生長性能。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加50 mg/kg血根堿顯著提高了斷奶仔豬的ADG和ADFI，顯著降低了腹瀉率，并達到與抗生素相當(dāng)?shù)男Ч?，這與上述研究結(jié)果基本一致，其促生長作用機理可能是：1)血根堿與色氨酸結(jié)構(gòu)相似，具有類似的含氮環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可以抑制腸道內(nèi)芳香族氨基酸脫羧酶活性，減少芳香族氨基酸降解，提高仔豬對色氨酸、苯丙氨酸在小腸中的利用效率，增加蛋白質(zhì)的沉積[25]；2)也可能是由于血根堿具有抗氧化功能，降低了肌肉的抗氧化反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激[13]；3)還可能是因為飼糧中添加血根堿增加了空腸和回腸相對長度[14]，改變了腸道形態(tài)，進而促進了有效的營養(yǎng)吸收，提高了飼糧消化率，從而促進仔豬生長。

小腸作為動物消化、吸收的主要場所，常作為衡量動物消化吸收功能的重要指標(biāo)。小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性與否是保證動物消化吸收功能的關(guān)鍵。而小腸絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度及V/C值是反映小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能完整性最直接的指標(biāo)[26]。小腸絨毛高度越大，小腸吸收面積就越大；腸絨毛寬度越大、隱窩越深，消化吸收功能就越低；V/C值越大，消化吸收能力就越強[27]。Lee等[14]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加血根堿增加了肉雞空腸和回腸相對長度。賀喜等[28]研究表明，飼糧中添加博落回生物堿可以顯著提高黃羽肉雞V/C值。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加血根堿顯著提高了絨毛高度和V/C值，且有降低空腸隱窩深度的趨勢，這與血根堿促進斷奶仔豬生長性能的結(jié)果相一致[29]。上述結(jié)果說明血根堿可以改善斷奶仔豬腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的發(fā)育，從而提高對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，進而提高動物的生長性能。李杰等[30]利用體外培養(yǎng)豬腸道上皮細胞(intestinal porcine epithelial cells，IPEC-1)研究表明，血根堿濃度在0.006 25～0.1 μg/mL對IPEC-1的增殖有顯著的促進作用。這說明血根堿可能通過促進小腸細胞增殖分化更新，從而增強小腸消化、吸收、免疫屏障和應(yīng)激反應(yīng)等。此外，血根堿改善小腸黏膜組織結(jié)構(gòu)還可能與血根堿作為抗菌物質(zhì)，能夠抑制大腸桿菌等病原菌在腸道上定植，增加腸道乳酸桿菌的數(shù)量[31]，從而對腸道黏膜起到保護作用有關(guān)。本試驗中，血根堿與抗生素對斷奶仔豬小腸生長發(fā)育的影響無顯著差異?？股乜捎行б种撇≡脑鲋?，但會破壞胃腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，血根堿能夠通過競爭性抑制有害病原菌的繁殖[32-34]，從而對腸道菌群結(jié)構(gòu)起到保護作用[14]。同時，這也在一定程度解釋了血根堿降低斷奶仔豬腹瀉的原因。對于血根堿對斷奶仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)和腸道發(fā)育的影響，還需進一步深入研究。

動物試驗證明博落回具有較好的免疫增強作用，可提高血清白蛋白/球蛋白值，對T淋巴細胞和B淋巴細胞功能均有刺激作用[35-36]。血根堿作為博落回中主要有效成分，近幾年，中國一些獸藥公司把血根堿作為免疫增強劑添加到飼料中，用于提高動物的免疫力。滿意等[37]研究表明，飼糧中添加博落回提取物能夠提高斷奶仔豬血清IgG含量，顯著改善免疫功能，明顯增強斷奶仔豬抗病能力，從而改善生長性能，且其效果優(yōu)于土霉素。本試驗結(jié)果顯示，飼糧中添加血根堿可顯著提高斷奶仔豬小腸黏膜IgA、IgG和IgM含量，達到與抗生素相當(dāng)?shù)男Ч?，這與云龍[16]和何夏陽[29]的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié) 論

飼糧中添加血根堿可以改善腸黏膜形態(tài)，提高小腸黏膜免疫功能，從而提高斷奶仔豬的生長性能，達到與添加抗生素相當(dāng)?shù)男Ч?。結(jié)果提示，血根堿可有效緩解斷奶應(yīng)激，用于減少或替代抗生素在斷奶仔豬飼糧中的使用。

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