朱曉彤 張方亮 尹 杰 黎育穎 韓 慧 賓石玉* 李鐵軍 印遇龍

(1.廣西師范大學生命科學學院，桂林 541006；2.中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術研究中心，農業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學觀測實驗站，長沙 410125；3.中國科學院大學，北京 100039；4.湖南畜禽安全生產協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙 410128)

半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)多為豆科植物多糖，是植物中常見主要碳水化合物儲備方式[1-2]。GM屬于甘露聚糖最復雜的亞科，α-半乳甘露聚糖(α-galactomannan,α-GM)和β-半乳甘露聚糖(β-galactomannan,β-GM)是GM的重要組成部分[3]，其均由β-1,4糖苷鍵連接[4]。飼糧中植物細胞壁存儲的大量GM不能被單胃動物消化，因為單胃動物腸道中缺乏靶向β-1,4糖苷鍵的必需酶[5]。對于動物而言，飼糧中大量的存在GM可阻礙其對細胞內營養(yǎng)物質的吸收，導致營養(yǎng)利用率降低[6]，甚至大大增加肺曲霉病發(fā)生的可能[7]。β-甘露聚糖酶(β-mannanase,β-MN)可以將GM的β-1,4糖苷鍵從植物細胞壁中分解，使其成為甘露寡糖等小分子[8]，有效減少飼糧中的α-GM、β-GM和GM含量，從而提高飼糧營養(yǎng)物質利用效率，改善動物健康，有利于養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

鑒定生物系統(tǒng)中血清生化指標可以反映豬的炎癥程度[9-10]。飼糧添加β-MN可顯著降低仔豬血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶活性，一定程度上緩和了仔豬的斷乳應激[11]。飼糧添加β-MN可以改善仔豬生長性能，提高飼糧利用效率[12]，還可增加機體氨基酸消化系數，促進氨基酸的吸收[13]，當體內氨基酸吸收變化時，哺乳動物細胞氨基酸基因的表達也變化[14]。盡管飼糧中添加β-MN可調控生豬生長性能和生理機能，但β-MN對斷奶仔豬血清α-GM、β-GM和GM含量和生化指標以及腸道中氨基酸轉運載體的表達的影響還沒有系統(tǒng)的研究。

植物飼料原料中GM對動物生理機能具有不利影響，但飼料原料中GM的含量卻鮮有報道，本試驗檢測了飼料原料中的α-GM、β-GM和GM的含量，并通過過量添加豆粕(soybean meal,SBM)提高了α-GM、β-GM和GM含量后，在飼糧中添加β-MN，研究β-MN在飼糧增加α-GM、β-GM和GM含量后，斷奶仔豬腸系膜靜脈、肝門靜脈、頸動脈血中血清α-GM、β-GM和GM含量，血清生化指標以及腸道溶質載體家族7成員1(SLC7A1)、溶質載體家族7成員11(SLC7A11)、溶質載體家族38成員2(SLC38A2)基因相對表達量的影響，探討了β-MN對α-GM、β-GM和GM的作用效應，為β-MN對GM的作用機理研究提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

β-MN購自美國Elanco公司，活性為360 MU/kg。選取24頭21日齡健康二元雜交斷奶閹公仔豬，預飼6 d，初始體重為(9.00±1.17) kg時，按照2×2因子設計，采用完全隨機的方法將仔豬分為4組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)，每組6個重復，每個重復1頭豬，單欄飼養(yǎng)。各組分別飼喂4種試驗飼糧。Ⅰ組飼喂22% SBM水平飼糧，Ⅱ組飼喂22% SBM水平并添加0.02% β-MN的飼糧，Ⅲ組飼喂37% SBM水平飼糧，Ⅳ組飼喂37% SBM水平并添加0.02% β-MN的飼糧。飼糧參照NRC(2012)仔豬營養(yǎng)需要配制，并根據SBM水平調節(jié)試驗飼糧的α-GM、β-GM和GM含量。飼糧制成顆粒料，所有飼糧消化能一致，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在湖南新五豐股份有限公司永安分公司的中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所動物實驗基地進行。試驗豬在相同環(huán)境下飼養(yǎng)，單欄飼喂，自由飲水和采食，每天飼喂4次(07:00、11:00、14:00、18:00)，并記錄采食量，自然光照和通風，執(zhí)行常規(guī)免疫程序。預試期6 d，正試期30 d。

本試驗程序需要說明的是：鑒于本試驗目的是為了研究斷奶仔豬高SBM飼糧與β-MN對血清聚糖含量、生化指標及腸道氨基酸轉運載體基因表達的影響，為了保障研究的持續(xù)性和完整性，在正試期內(30 d)，斷奶2周后的試驗仔豬持續(xù)使用添加了高鋅(氧化鋅)的4種試驗飼糧，這僅針對本研究的需要。而有關鋅的使用，應按國家相關規(guī)定執(zhí)行。試驗結束后，對24頭斷奶仔豬麻醉采集頸動脈、腸系膜靜脈以及肝門靜脈血樣各10 mL，檢測血清中α-GM、β-GM和GM含量；采集前腔靜脈血樣10 mL，檢測血清生化指標；并取空腸前端和回腸后端，檢測氨基酸轉運載體SLC7A1、SLC7A11和SLC38A2基因相對表達量。在采樣結束后，所有試驗仔豬已根據國家相關規(guī)定進行無公害化處理。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1)礦物質預混料為每千克飼糧提供 The mineral premix provided the following per kg of diets：Cu 150 mg，Fe 170 mg，Co 1.9 mg，Mn 80 mg，Zn 77 mg，I 0.3 mg，Se 0.12 mg。

2)多維可為每千克飼糧提供 The multi-vitamin provided the following per kg of diets：VA 4 875 IU，VD31 500 IU，VE 12 mg，VK31.5 mg，VB61.8 mg，VB1215 mg，煙酸 nicotinic 15 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 7.5 mg。

3)營養(yǎng)水平均為計算值。α-GM、β-GM和GM含量是根據表3結果，通過玉米和豆粕在試驗飼糧中的比例計算得出。Nutrient levels were calculated values. According to the results of Table 3, the contents of α-GM, β-GM and GM were calculated by the ratio of corn and soybean meal in experimental diets.

1.3 樣本采集

于正試期第30天對24頭斷奶仔豬進行禁食12 h，注射麻藥Zoletil 50(Virbac S.A.公司，法國)后屠宰，先采集頸動脈、前腔靜脈血樣各10 mL，剖開腹腔，采集肝門靜脈以及腸系膜靜脈血樣各10 mL，血樣靜置3 h，3 000 r/min、離心10 min制備血清，上清液移入離心管中，置于-80 ℃冰箱中保存。迅速采集空腸前端(2 cm)和回腸后端(2 cm)樣品，生理鹽水洗凈后，錫箔紙包樣，并放入液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.4 飼料原料與血清中α-GM、β-GM和GM含量測定

飼料原料與血清中α-GM、β-GM和GM含量的測定采用試劑盒，試劑盒均采購于上海酶聯生物科技有限公司，并由上海酶聯生物科技有限公司檢測。

1.5 平均日采食量(ADFI)及平均日采食α-GM、β-GM和GM含量測定

試驗期間記錄試驗豬的日采食量，計算1～30 d的ADFI，根據采食量及飼糧中α-GM、β-GM和GM含量，計算1～30 d平均日采食α-GM、β-GM和GM含量。

1.6 血清生化指標測定

谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,GOT)活性及尿素氮(urea nitrogen,UN)、肌酐(creatinine,CREA)、葡萄糖(glucose,GLU)、鈣(calcium,Ca)、磷(phosphorus,P)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、補體4(complement 4,C4)含量均使用羅氏生化檢測試劑盒和COBAS C311型羅氏生化自動分析儀(Roche公司，德國)進行檢測。

1.7 氨基酸轉運載體基因表達測定

研磨從液氮冷凍的腸道組織，使用Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)分離總RNA，所有樣品總RNA均稀釋至1 μg/μL。然后根據制造商的說明書用DNase Ⅰ(Invitrogen公司，美國)對總RNA消化，以去除基因組DNA污染。采用上海生物工程有限公司反轉錄試劑盒對上述DNA消化產物進行反轉錄，獲得樣品總RNA的cDNA產物，體系為20 μL，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。根據豬的基因序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)使用Prime 5.0設計引物以產生擴增產物，引物由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列及參數見表2。將1 μL cDNA模板加入的含有5 μL SYBR Green Premix (2×，預混MgCl2、dNTP、SYBR Green Ⅰ染料、EX-Taq聚合酶、Buffer)，0.4 μmol/L正向和反向引物各0.5 μL，去離子水補齊總體積為10 μL。PCR循環(huán)設置為：1)預熱程序，95 ℃、10 s；2)擴增和定量程序，重復40個循環(huán)(95 ℃、5 s，60 ℃、20 s)；3)熔化曲線程序，60～99 ℃，溫度升高速率為0.1 ℃/s。反應結束后，分別得到各樣品的β-肌動蛋白(β-actin)基因以及各目的基因引物PCR擴增的Ct值，根據公式2-△Ct=2-(Ct目的基因-Ctβ-actin)計算基因相對表達量。

表2 實時定量PCR引物序列

1.8 數據分析

試驗數據采用Excel 2007進行初步整理，用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件的GLM程序進行統(tǒng)計分析，數據模型包括SBM和β-MN以及兩者的交互作用對數據結果產生的影響，并采用Duncan氏多重比較法以評估各組之間的差異，結果以“平均值±標準誤”表示，P<0.05時為差異顯著，P<0.01時為差異極顯著。

2 結 果

2.1 常用植物飼料原料中α-GM、β-GM和GM含量

由表3中相關常用植物蛋白質飼料原料和能量飼料原料中α-GM、β-GM和GM含量的實際檢測值可知，在22種植物飼料原料中，除了發(fā)酵豆粕、蠶豆和黑豆外，飼料原料中β-GM含量均明顯高于α-GM的含量，而GM含量則高于α-GM和β-GM含量的總和。因此，在飼糧配制過程中需要考慮α-GM、β-GM和GM含量。

表3 22種飼糧中常用蛋白質原料和能量原料的α-GM、β-GM和GM含量

2.2 β-MN和SBM對斷奶仔豬ADFI及平均日采食α-GM、β-GM和GM含量的影響

由表4可知，與Ⅰ組相比，Ⅱ組斷奶仔豬的ADFI以及平均日采食α-GM、β-GM和GM含量沒有顯著變化(P>0.05)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組斷奶仔豬的ADFI顯著提高(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅳ組斷奶仔豬的平均日采食α-GM含量顯著增加(P<0.05)；與Ⅰ組相比，Ⅲ組斷奶仔豬ADFI顯著降低(P<0.05)，平均日采食α-GM含量顯著升高(P<0.05)，這表明，在不添加β-MN的情況下，高水平SBM飼糧可顯著提高仔豬平均日采食α-GM含量(P<0.01)。

2.3 β-MN和SBM對斷奶仔豬不同部位血清α-GM、β-GM和GM含量的影響

由表5可知，在頸動脈血清中，與Ⅰ組相比，Ⅱ組血清α-GM含量降低了37.70%(P>0.05)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組血清α-GM含量降低了16.90%(P>0.05)，這表明β-MN可降低頸動脈血清中α-GM含量(P=0.02)。與Ⅰ組相比，Ⅲ組血清β-GM含量顯著升高(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅳ組血清β-GM含量顯著升高(P<0.05)，這表明過量添加SBM可顯著增加仔豬頸動脈血清β-GM含量(P<0.01)。

表4 β-MN和SBM對斷奶仔豬ADFI及平均日采食α-GM、β-GM和GM含量的影響

同行數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

在腸系膜靜脈血清中，與Ⅰ組相比，Ⅱ組血清α-GM含量顯著降低(P<0.05)，表明β-MN可降低腸系膜靜脈血清中α-GM含量(P=0.01)。與Ⅰ組相比，Ⅲ組血清β-GM含量顯著升高(P<0.05)，血清GM含量顯著升高(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅳ組血清α-GM和β-GM含量均顯著增加(P<0.05)，這表明過量添加SBM可顯著增加仔豬腸系膜靜脈血清中α-GM(P=0.04)、β-GM(P<0.01)和GM含量(P<0.01)。

在肝門靜脈血清中，與Ⅰ組相比，Ⅱ組血清α-GM和GM含量均顯著降低(P<0.05)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組血清GM含量顯著降低(P<0.05)，這表明β-MN可降低肝門靜脈血清中α-GM(P=0.02)和GM含量(P<0.01)。與Ⅰ組相比，Ⅲ組血清β-GM含量升高了40.24%(P>0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅳ組血清α-GM含量顯著升高(P<0.05)，這表明過量添加SBM可顯著增加仔豬肝門靜脈血清中α-GM(P=0.03)和β-GM(P=0.02)含量。

表5 β-MN和SBM對斷奶仔豬血清α-GM、β-GM和GM含量的影響

續(xù)表5項目ItemsⅠ組GroupⅠⅡ組GroupⅡⅢ組GroupⅢⅣ組GroupⅣP值P-value組間Group豆粕SBMβ-甘露聚糖酶β-MN互作Interaction腸系膜靜脈Mesentericveinα-半乳甘露聚糖α-GM145.68±6.82a90.82±7.65b173.52±16.60a146.17±26.82a0.010.040.010.62β-半乳甘露聚糖β-GM199.60±12.79bc171.27±9.61c247.39±11.26a221.13±15.15ab<0.01<0.010.060.97半乳甘露聚糖GM393.74±35.14b349.10±44.94b557.49±54.82a472.50±51.92ab0.03<0.010.400.78肝門靜脈Hepaticportalveinα-半乳甘露聚糖α-GM122.23±13.95a70.49±5.87b131.54±13.97a119.76±13.77a0.010.030.020.12β-半乳甘露聚糖β-GM175.26±17.79171.12±13.80245.78±29.22204.97±21.610.080.020.300.41半乳甘露聚糖GM368.94±12.60ab264.82±12.86c405.27±41.69a313.94±30.29bc<0.010.19<0.010.64

2.4 β-MN對斷奶仔豬前腔靜脈血清生化指標的影響

由表6可知，在前腔靜脈血清中，與Ⅰ組相比，Ⅱ組血清GLU、Ca和HDL含量均顯著升高(P<0.05)，且Ⅱ組比Ⅰ組血清P含量升高了32.47%(P>0.05)，這表明β-MN可顯著增加前腔靜脈血清GLU(P<0.01)、Ca(P<0.01)、P(P=0.02)和HDL(P<0.01)含量。

與Ⅰ組相比，Ⅲ組血清ALT、GOT活性和UN含量均顯著升高(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅳ組血清GOT活性顯著升高(P<0.05)，血清GLU含量顯著降低(P<0.05)，這表明過量添加SBM可顯著增加前腔靜脈血清ALT(P<0.01)、GOT(P=0.01)活性及UN(P<0.01)含量，顯著降低血清GLU含量(P<0.01)。

表6 β-MN和SBM對斷奶仔豬血清生化指標的影響

續(xù)表6項目ItemsⅠ組GroupⅠⅡ組GroupⅡⅢ組GroupⅢⅣ組GroupⅣP值P-value組間Group豆粕SBMβ-甘露聚糖酶β-MN互作Interaction鈣Ca/(mmol/L)1.89±0.22b2.67±0.05a1.98±0.17b2.36±0.26ab0.040.57<0.010.32磷P/(mmol/L)2.31±0.323.06±0.042.47±0.162.81±0.220.090.820.020.34高密度脂蛋白HDL/(mmol/L)0.60±0.08b1.07±0.06a0.86±0.08ab0.98±0.14a0.020.40<0.010.08補體4C4/(g/L)0.034±0.0020.036±0.0050.026±0.0020.038±0.0050.190.460.090.22

2.5 β-MN對斷奶仔豬空腸和回腸氨基酸轉運載體基因表達的影響

由表7可知，與Ⅰ組相比，Ⅱ組空腸SLC7A11基因相對表達量顯著升高(P<0.05)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組空腸SLC7A1、SLC7A11和SLC38A2基因相對表達量均顯著升高(P<0.05)。這表明β-MN可增加空腸氨基酸轉運載體SLC7A1(P=0.03)、SLC7A11(P<0.01)和SLC38A2(P=0.01)基因相對表達量。

與Ⅰ組相比，Ⅲ組回腸SLC7A1基因相對表達量顯著降低(P<0.05)，這表明過量添加SBM可以顯著降低回腸氨基酸轉運載體SLC7A1基因相對表達量(P=0.01)。

表7 β-MN和SBM對斷奶仔豬腸道中SLC7A11、SLC7A1和SLC38A2相對表達量的影響

3 討 論

植物性飼料原料中GM含量過多會造成胃腸道功能下降，增加腸道食糜黏度，降低飼料利用率[15]，對動物生理機能有害。本研究檢測了常見飼料原料中α-GM、β-GM和GM含量，并發(fā)現大部分飼料原料中β-GM含量明顯高于α-GM，且GM含量高于α-GM與β-GM含量總和，說明GM亞科中還含有其他分支的多聚糖。

在仔豬飼糧中添加GM可以降低仔豬腸道絨毛高度和乳酸桿菌數量[16]，從而降低仔豬飼糧營養(yǎng)利用率。在本試驗中，飼糧SBM水平由22%增加至37%后，仔豬采食量下降，而α-GM的采食量卻顯著增加，這可能是α-GM導致采食量下降的因素。GM是菌絲組織生長期間從細胞壁釋放的熱穩(wěn)定多糖成分，對曲霉菌的存活是必需的[17]。因此，仔豬采食過量GM，可導致曲霉肺炎等疾病的風險，嚴重危害仔豬健康。本研究通過檢測不同部位血清GM含量，從而明確了該部位對GM的吸收狀況。飼糧SBM水平由22%增加至37%后，仔豬頸動脈和腸系膜靜脈血清中β-GM含量均顯著增加，什么影響仔豬生理變化的主要因素可能是β-GM。有研究報道，GM可使胃腸道功能下降，增加腸道食糜黏度[15]，本試驗飼糧SBM水平增加使腸系膜靜脈中血清α-GM、β-GM和GM含量均顯著升高，改變了GM在腸道中的平衡，這可能是仔豬腸道生理功能改變的原因，但具體原因尚需進一步分析。肝臟屬于先天免疫系統(tǒng)[18]，而在肝門靜脈中，飼糧22%的SBM水平并添加β-MN后，血清α-GM和GM含量均顯著降低，我們推測β-MN可通過降低肝門靜脈血清中GM的含量來提高機體免疫能力。

血清生化指標對致病過程或治療干預的藥物反應具有指示性作用[19]。在試驗動物模型中，肝損傷可以通過血清ALT和GOT活性來估計，血清ALT和GOT活性升高表明嚴重的肝細胞損傷或壞死[20-21]，而血清UN含量的升高通常是由于腎臟損傷造成的小球濾過率降低[22]。本研究表明，飼糧SBM水平由22%增加至37%后，血清ALT、GOT活性及UN含量均顯著增加，提示SBM可破壞仔豬生理生化平衡，增加疾病風險。血清GLU和Ca含量反映了豬的能量狀況[23]和骨對Ca的吸收狀況[24]；HDL可通過將肝外組織中過多的膽固醇進行代謝，防止膽固醇在這些組織中過多地聚集，促進機體健康[25]。本研究表明，飼糧22%的SBM水平并添加β-MN后，可顯著增加血清GLU、Ca、HDL含量，提示β-MN可以提高仔豬能量利用率，促進仔豬骨對Ca的吸收和保持體內膽固醇平衡。

β-MN可以將SBM中GM降解為半乳甘露寡糖小分子，半乳甘露寡糖具有消除抗營養(yǎng)物質、提高飼糧消化率、促進氨基酸等營養(yǎng)物質的吸收等特點[4]。氨基酸轉運載體可通過偶聯轉運過程調節(jié)細胞內氨基酸濃度和細胞內氨基酸受體的下游信號，將氨基酸等營養(yǎng)信息以及營養(yǎng)物質本身轉移到細胞需要的位置[26]。SLC7A1用于在哺乳動物細胞堿性氨基酸(精氨酸和賴氨酸)攝取和轉運，其中SLC7A1的相對表達量上調，細胞內堿性氨基酸(精氨酸和賴氨酸)濃度也會隨之上調[27-28]。SLC7A11屬于溶質轉運蛋白基因家族，編碼胱氨酸/谷氨酸轉運體xCT[29]，上調SLC7A11可促進谷氨酸的吸收[30]。SLC38A2維持細胞內L-谷氨酰胺含量并作用中性氨基酸轉運入細胞[31]。SLC38A2的相對表達量越高，其組織中中性氨基酸濃度越高[32]。本試驗結果表明，在37% SBM水平飼糧中添加β-MN，空腸SLC7A1、SLC7A11和SLC38A2相對表達量均顯著升高。這可能是由于β-MN通過破壞腸系膜靜脈中過量GM的β-1,4糖苷鍵，從而促進了空腸中SLC7A1、SLC7A11和SLC38A2相對表達量的增加。飼糧SBM水平由22%增加至37%時，回腸中SLC7A1的相對表達量降低，提示SBM可通過降低SLC7A1的相對表達量降低仔豬腸道對堿性氨基酸(精氨酸和賴氨酸)的吸收。

4 結 論

① 在大部分常用飼料原料中，β-GM含量比α-GM的含量高。

② 斷奶仔豬平均日采食α-GM含量增加時，ADFI會隨之降低。

③ 飼糧中α-GM、β-GM和GM含量增加時，斷奶仔豬肝門靜脈、頸動脈和腸系膜靜脈血清α-GM、β-GM和GM含量也會增加。

④ 飼糧添加β-MN可以降低斷奶仔豬血清α-GM、β-GM和GM含量，同時增加了前腔靜脈血清GLU、Ca、P和UN含量，提高了空腸SLC7A1、SLC7A11、SLC38A2的相對表達量。

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