任思蕊, 王冰蕊, 郭 青, 馮甜甜, 王 鼎, 高 潔, 石莉紅

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院(血液學(xué)研究所), 實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300020

表觀遺傳是在DNA序列信息不變的情況下，細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生的可遺傳改變，方式主要有DNA和組蛋白的修飾、染色質(zhì)的重塑等[1]。表觀遺傳學(xué)參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在已有的白血病研究中，發(fā)現(xiàn)許多原癌基因和抑癌基因的啟動子區(qū)域CpG島發(fā)生異常的甲基化修飾，例如ABLl(P1)基因[2]、ECAD基因[3]、EphA3基因[4]等。但是關(guān)于組蛋白修飾參與白血病發(fā)生的研究較少。

在構(gòu)成染色質(zhì)的組蛋白上，可以發(fā)生甲基化、乙酰化、泛素化等多種修飾，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)[5]。LSD1是組蛋白去甲基酶，它催化組蛋白賴氨酸特異的去甲基反應(yīng)從而完成對組蛋白的修飾，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄[6]。LSD1在哺乳動物造血系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生理作用。LSD1敲除的小鼠胚胎發(fā)育7.5d死亡，通過對LSD1條件敲除小鼠模型的研究顯示，LSD1在造血發(fā)生過程中高表達(dá)，并且對紅系、巨核系、粒系細(xì)胞的終末分化必不可少[7]。在AML細(xì)胞中，通過抑制LSD1的活性，降低了AML細(xì)胞的集落形成能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]，這暗示LSD1可能通過組蛋白修飾參與白血病的發(fā)展。

在我們的前期實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了人慢性髓系白血病K562的LSD1基因敲除株，發(fā)現(xiàn)LSD1的敲除顯著抑制了CD235a的表達(dá)，并且顯著減慢了K562細(xì)胞的增殖速度[9]。為了探究LSD1敲除后K562細(xì)胞增殖變慢的原因，本研究利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的改變以及細(xì)胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)敲除LSD1后，不影響K562細(xì)胞凋亡水平；但是細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變，阻滯在G0/G1期的細(xì)胞變多，S期和G2/M期的細(xì)胞變少，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的增殖變慢。

1 材料方法

1.1 儀器與試劑

流式細(xì)胞儀LSR II(美國BD公司)；K562細(xì)胞系原購自美國ATCC公司，后經(jīng)由本實(shí)驗(yàn)室保存； K562細(xì)胞LSD1純合敲除株(LSD1-/-)、雜合敲除株(LSD1+/-)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，傳代并凍存；細(xì)胞培養(yǎng)所用的胎牛血清、L-谷氨酰胺、RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素抗生素、丙酮酸鈉等細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購自美國Gibco公司; 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

K562細(xì)胞使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液為RPMI 1640，添加1%的青霉素-鏈霉素、1%的L-glutamine以及10%的胎牛血清，K562細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃恒溫、5% CO2孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)密度為1×105個(gè)/mL，細(xì)胞密度達(dá)到1×106個(gè)/mL時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3 K562細(xì)胞凋亡檢測

試劑稀釋：細(xì)胞凋亡檢測試劑盒中提供的5×Binding Buffer，使用無菌PBS稀釋至1×Binding Buffer，4℃預(yù)冷。

K562細(xì)胞的準(zhǔn)備：K562細(xì)胞計(jì)數(shù)取1×106個(gè)細(xì)胞，300 g離心5 min，棄上清，用PBS緩沖液清洗1遍，吸棄上清后使用100 μL 1×Binding Buffer將細(xì)胞重懸。

細(xì)胞染色：加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min；上機(jī)檢測前5 min再加入5 μL的PI染料并補(bǔ)加200 μL的1×Binding Buffer。

制備好的細(xì)胞懸液使用流式細(xì)胞儀LSRⅡ檢測細(xì)胞凋亡比例，使用FITC和PI兩個(gè)通道，檢測結(jié)束后用軟件FlowJo7.6.1進(jìn)行分析，流式細(xì)胞儀檢測顯示的細(xì)胞分布在四象限內(nèi)，Annexin V-/PI-為活細(xì)胞，Annexin V+/PI-和Annexin V+/PI+為早期凋亡以及晚期凋亡的細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞周期檢測

細(xì)胞固定：收集細(xì)胞并用PBS洗滌，300 g離心5 min后棄掉上清；每組細(xì)胞中加入1 mL 70%乙醇，混勻后4℃固定24 h以上。

細(xì)胞染色與檢測：取固定完畢的細(xì)胞，使用PBS清洗一遍，300 g離心5 min后棄掉上清。重新加入50 μL PBS及3 μL核糖核酸酶，室溫孵育10 min后加入150 μL PI的PBS溶液，室溫避光染色10 min；染色后使用LSR II流式細(xì)胞儀檢測，并使用ModFit程序分析G0/G1，S和G2/M期細(xì)胞比率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

2 結(jié)果與分析

2.1 LSD1基因敲除對K562細(xì)胞增殖周期的影響

前期研究中發(fā)現(xiàn)，敲除LSD1基因后K562細(xì)胞增殖受到顯著抑制，LSD1+/-細(xì)胞株增殖速度顯著慢于WT組，LSD1-/-細(xì)胞株的增殖速度與WT組相比，差異極顯著[9]。為了進(jìn)一步探究敲除LSD1基因后K562細(xì)胞增殖受到顯著抑制的原因，本實(shí)驗(yàn)檢測了K562細(xì)胞的增殖周期，細(xì)胞周期中的G0和G1期是DNA合成前期，進(jìn)入S期后DNA開始合成，G2期DNA合成結(jié)束。將培養(yǎng)中的K562細(xì)胞野生型、LSD1+/-、LSD1-/-細(xì)胞株同時(shí)進(jìn)行PI染色，PI可以與DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量(圖1A)。分析3株細(xì)胞所處細(xì)胞周期內(nèi)各階段細(xì)胞比例，結(jié)果顯示敲除LSD1后，被阻滯在G1期的細(xì)胞比例升高，然而在S期的細(xì)胞比例明顯降低，進(jìn)入G2/M期的細(xì)胞比例也降低(圖1B)。以上結(jié)果表明，敲除LSD1基因后K562細(xì)胞的增殖周期被阻滯在G0/G1期，進(jìn)入DNA復(fù)制期的細(xì)胞減少，從而使進(jìn)入分裂狀態(tài)細(xì)胞比例減少，細(xì)胞增殖減慢。

圖1 LSD1敲除對K562細(xì)胞增殖周期的影響Fig.1 Effects of LSD1 knockout on the cell cycle of K562 cells.A.PI染色以及流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布比例;B.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布比例。*表示P<0.1水平差異顯著，**表示P<0.01水平差異顯著，***表示P<0.001水平差異顯著。

2.2 LSD1基因敲除對K562細(xì)胞凋亡水平的影響

為了探究LSD1+/-和LSD1-/-細(xì)胞株增殖減慢的原因，除細(xì)胞周期改變外，是否由于敲除基因LSD1影響細(xì)胞凋亡水平所引起，本實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)中的K562細(xì)胞野生型、LSD1+/-、LSD1-/-細(xì)胞株同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，并使用軟件FlowJo7.6.1分析，Annexin V-/PI-為活細(xì)胞，Annexin V+/PI-和Annexin V+/PI+為早期凋亡以及晚期凋亡的細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)分析凋亡細(xì)胞的總比率，結(jié)果顯示: 敲除LSD1后，不影響K562細(xì)胞凋亡水平(圖2)。

3 討論

LSD1又名KDM1A，是胺氧化酶家族中的一員，其C端具有AOL結(jié)構(gòu)域，主要包括FAD(黃素腺嘌吟二核苷酸)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化活性中心兩個(gè)部分，在FDA的參與幫助下，LSD1可以與組蛋白底物結(jié)合，特異催化組蛋白H3K9me1/2和H3K4me1/2去甲基化[10～12]。

研究表明，組蛋白修飾在生理以及病理狀態(tài)下的造血過程中均發(fā)揮核心作用。在急性白血病患者的基因組中，由于染色質(zhì)修飾基因的各種后天病變，或其表達(dá)水平的變化，表觀遺傳學(xué)的整體狀態(tài)發(fā)生明顯改變[13]。在多種血液系統(tǒng)淋系和髓系惡性腫瘤中，組蛋白-賴氨酸-N-甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2被證明發(fā)生了突變[14]；組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L的小分子抑制劑顯示出對MLL(混合譜系白血病)的臨床治愈性[15,16]；另外，組蛋白去甲基轉(zhuǎn)移酶KDM5A(JARID1A)、KDM5C(JARID1C)和KDM6A(UTX)在實(shí)體以及血液系統(tǒng)腫瘤中均出現(xiàn)了大規(guī)模重復(fù)性突變，因此LSD1/KDM1A也一度成為臨床治療AML的研究熱點(diǎn)[17]。LSD1在AML(急性髓系白血病)中高表達(dá)，多種LSD1抑制劑在臨床應(yīng)用中展現(xiàn)出對AML一定的治療作用[18]，在MLL-AF9+AML細(xì)胞中，敲低LSD1的表達(dá)水平，H3K4me2/H3K4me3比例升高從而降低了白血病發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)[19～21]。但是關(guān)于LSD1在白血病細(xì)胞分化、增殖以及凋亡的研究比較少。

圖2 LSD1基因敲除對K562細(xì)胞凋亡水平的影響Fig.2 The effect of LSD1 knockout on apoptosis level of K562 cells.

K562細(xì)胞是研究白血病發(fā)病機(jī)理的重要模型，我們在前期的實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)使用人慢性髓系白血病K562細(xì)胞，利用 CRISPR/Cas9技術(shù)對K562細(xì)胞的LSD1 Exon1進(jìn)行定點(diǎn)切割，并獲得了LSD1+/-、LSD1-/-K562細(xì)胞株，通過對敲除株的研究發(fā)現(xiàn)，LSD1+/-、LSD1-/-K562細(xì)胞株的紅系特異性表面標(biāo)記CD235a的表達(dá)被顯著抑制，并且與LSD1的表達(dá)呈劑量依賴關(guān)系。因此我們推測，LSD1可能參與調(diào)控了K562細(xì)胞紅系分化過程中的紅細(xì)胞成熟進(jìn)程。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)LSD1+/-、LSD1-/-K562細(xì)胞株的增殖能力明顯下降，這暗示了LSD1基因的抑制能夠有助于白血病的治療，因此本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞凋亡檢測，驗(yàn)證了敲除LSD1基因后，K562細(xì)胞凋亡水平并未受到影響。同時(shí)，數(shù)據(jù)顯示野生型K562細(xì)胞凋亡很不明顯，因此有必要進(jìn)一步研究在饑餓或誘導(dǎo)劑處理下，LSD1對K562細(xì)胞凋亡是否有影響。另外，敲除LSD1基因后，野生型和敲除株細(xì)胞的K562細(xì)胞被阻滯在細(xì)胞周期的G0/G1期，進(jìn)入DNA復(fù)制期的細(xì)胞變少，細(xì)胞增殖明顯減慢；結(jié)果中細(xì)胞周期改變與LSD1敲除比例未出現(xiàn)明顯的計(jì)量依賴性，因此認(rèn)為，除了影響細(xì)胞周期外，可能還存在其他的信號通路，受到LSD1敲除的影響從而減慢了細(xì)胞的增殖。

綜上所述，LSD1基因K562細(xì)胞在紅系分化進(jìn)程中至關(guān)重要，并且起到維持細(xì)胞凋亡平衡狀態(tài)以及細(xì)胞順利增殖的作用。因此，抑制LSD1的活性，理論上可以成為治療白血病的策略手段。同時(shí)，本研究也為臨床上LSD1抑制劑治療白血病提供了有效的理論依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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