胡爭艷, 王軍淋, 吳平谷, 王天嬌, 王立媛, 湯 鋆

浙江省疾病預防控制中心, 杭州 310051

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對肉食的需求量越來越大，同時也對肉類的品質(zhì)提出了更高的要求。此外，多種市售深加工肉制品因其食用方便受到了廣大消費者的歡迎，但是這也對深加工肉制品(特別是熟肉制品)中肉類的鑒別及其品質(zhì)把控提出了挑戰(zhàn)。

目前，肉制品中肉類的鑒別方法主要包括[1～3]：以DNA檢測為基礎(chǔ)的多重PCR法、限制性片段長度多態(tài)性PCR法、隨機擴增多態(tài)性PCR法、熒光定量PCR法等；以蛋白質(zhì)檢測為基礎(chǔ)的電泳分析法、免疫分析法、色譜分析法等；還有紅外光譜法、核磁法、電子鼻技術(shù)等。雖然這些檢測技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)明顯提高了肉類鑒別的精確度和靈敏度，但是也都存在著較大的局限性。其中，PCR法因其具有較好的檢測靈敏度和特異性，目前應用較為廣泛，但由于PCR法容易出現(xiàn)交叉污染，因此對于樣本制備的要求較高，而且容易受到肉制品加工過程中出現(xiàn)的DNA降解、復雜基質(zhì)干擾等因素的影響而出現(xiàn)假陽性或假陰性的鑒定結(jié)果[4]。而蛋白質(zhì)電泳法不適用于深加工及混合不同肉類的肉制品的分析。免疫分析法對于親緣關(guān)系較近的物種易出現(xiàn)交叉反應，產(chǎn)生假陽性結(jié)果，且單克隆抗體雖然能大幅提高檢測特異性，但其制備成本昂貴、步驟繁雜，因此難以推廣應用。另外，在肉制品的加工過程中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)會發(fā)生不可逆的改變，導致其溶解性降低，難以采用色譜分析法進行檢測。雖然，紅外光譜法、核磁法具有檢測快速無損耗、無需樣品前處理的優(yōu)點，但其精確度較低且不適用于復雜混合樣品的檢測。而電子鼻技術(shù)目前仍處于發(fā)展階段，其在肉制品檢測中的靈敏度、識別率等尚未達到令人滿意的程度。因此，蛋白質(zhì)組學技術(shù)的快速發(fā)展為探索肉制品中肉類的鑒別提供了新的研究思路。

肉的品質(zhì)是指與肉的外觀、適口性和營養(yǎng)價值等有關(guān)的物理、化學特性的綜合體現(xiàn)，包括肉的顏色、pH、保水性指標(滴水損失)等，是決定消費者感官享受的重要因素[5]。一般來說，肉質(zhì)的形成受到多種因素的影響，其中包括遺傳(品種、基因型等)、營養(yǎng)因素(氨基酸水平、飼料添加劑等)、飼養(yǎng)方式、屠宰和儲存條件等[6]，然而，影響其品質(zhì)形成的潛在分子機制尚未研究清楚。而蛋白質(zhì)組學技術(shù)的應用為探索肉類品質(zhì)形成的影響因素提供了新的研究視角。雖然，目前蛋白質(zhì)組學在肉類鑒別和肉質(zhì)研究中的應用尚處于早期階段，但已經(jīng)展現(xiàn)出了較好的前景。本文將對蛋白質(zhì)組學的定義、主要研究策略及其在肉類鑒別和肉質(zhì)研究中的應用進行介紹。

1 蛋白質(zhì)組學及其主要研究策略

作為后基因組時代的核心，蛋白質(zhì)組學(proteomics)是指通過生物及化學方法對細胞、組織等生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)進行全面分析的一門學科[7]。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)樣品分析通常是基于二維凝膠電泳(2D SDS-PAGE)色譜系統(tǒng)，它具有蛋白分離效率高的特點，但也存在操作步驟繁瑣、重現(xiàn)性差、不適合分離疏水性蛋白及分子量極大或極小的蛋白等問題。此外，分離后蛋白質(zhì)的鑒定需要通過Edman降解法進行氨基酸測序，極大程度上限制了蛋白質(zhì)樣品分析的通量[8～10]。20世紀90年代以來，生物質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)樣品的大規(guī)模分析，使蛋白質(zhì)組學研究取得了突破性進展?；谏镔|(zhì)譜的蛋白質(zhì)分析法現(xiàn)已成為蛋白質(zhì)組學研究的核心內(nèi)容[11,12]。

隨著蛋白質(zhì)組學研究的不斷深入，僅提供蛋白質(zhì)鑒定信息的分析策略已不能滿足當前研究工作的需要，而準確地定位生物體不同狀態(tài)下發(fā)生變化的蛋白質(zhì)則是目前研究的難點，這對蛋白質(zhì)定量分析技術(shù)即差異蛋白質(zhì)組學的發(fā)展提出了要求。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)定量分析主要是通過2D SDS-PAGE顯色反應來實現(xiàn)的，其能同時定量上千種蛋白質(zhì)的表達差異，是蛋白質(zhì)組學技術(shù)早期應用于肉質(zhì)分析中的主要研究方法。

近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，基于質(zhì)譜分析的定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)也得到了快速發(fā)展，被廣泛應用于生命活動的研究中?；谫|(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)定量策略主要有無標記定量和同位素標記相對定量兩種方法(表1)。無標記定量技術(shù)是基于多次質(zhì)譜分析的結(jié)果，因此，樣品分析時要求穩(wěn)定的液相色譜分離系統(tǒng)及良好的質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)重現(xiàn)性，以保證定量結(jié)果的準確性和可靠性。但同時由于其不需要對樣品進行同位素標記等步驟，不會增加樣品的復雜程度，操作簡單，現(xiàn)多應用于肉質(zhì)分析領(lǐng)域。而同位素標記定量技術(shù)根據(jù)同位素標記引入的方式又分為體內(nèi)標記和體外標記。其中，體內(nèi)標記方法省去了標記反應和分離純化的步驟，減少了樣品的損失，提高了蛋白質(zhì)定量的準確性，但是，重同位素標記蛋白質(zhì)的標記周期較長、成本較高。體外標記方法主要包括通過將標記試劑與蛋白質(zhì)或肽段中的氨基酸反應引入穩(wěn)定同位素的化學標記方法以及在蛋白質(zhì)的酶解過程中引入穩(wěn)定同位素的酶解標記方法(酶促標記)。其中，二甲基標記技術(shù)因具有標記效率高、反應迅速、標記試劑價格低等優(yōu)點，已經(jīng)成為應用最為廣泛的化學標記方法。而酶解標記方法主要是指蛋白質(zhì)在酶解的過程中使用H218O，在蛋白酶的作用下使肽段C端增加2個18O原子，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的定量分析。目前，基于同位素標記的定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)也已開始逐漸應用于肉質(zhì)分析的研究中。

然而，上述蛋白質(zhì)組學的定量方法均是通過高分辨質(zhì)譜檢測而實現(xiàn)的生物樣本中信號強度較強(較高豐度)的蛋白質(zhì)的相對定量，具有高通量的優(yōu)點，但也表現(xiàn)出明顯的局限性，即上述方法中蛋白質(zhì)的定量結(jié)果具有非靶向性，而且無法實現(xiàn)樣品中信號強度較弱(較低豐度)的蛋白質(zhì)的定量，約束了檢測的靈敏度。因此，為了增加蛋白質(zhì)定量分析的特異性和準確性，提高對于目標蛋白質(zhì)(尤其是低豐度目標蛋白質(zhì))定量分析的靈敏度，以蛋白質(zhì)的特異性肽段為分析對象的靶向蛋白質(zhì)組學定量方法逐步得到了發(fā)展[25]。靶向蛋白質(zhì)組學定量方法主要包括2種技術(shù)：選擇/多反應監(jiān)測(selected/multiple reaction monitoring，SRM/MRM)[26,27]和平行反應監(jiān)測(parallel reaction monitoring，PRM)[28,29]。SRM/MRM技術(shù)是利用三重四級桿質(zhì)譜對目標蛋白質(zhì)中特定肽段的母離子和子離子依次進行分選，從而實現(xiàn)對目標蛋白的定量分析，具有靈敏度高、準確性好的特點。而PRM技術(shù)則是在SRM/MRM的基礎(chǔ)上，同時利用了四級桿的高選擇性以及靜電場軌道阱(Orbitrap)的高分辨率、高精度的特性來實現(xiàn)對目標蛋白的定量分析，具有更加優(yōu)異的抗干擾能力和檢測靈敏度。目前，靶向蛋白質(zhì)組學定量方法在肉類鑒定方面得到了廣泛的應用。

表1 定量蛋白質(zhì)組學主要分析方法Table 1 The main analysis methods of quantitative proteomics.

注：+和++分別代表標記效率較高、非常高；￥、￥￥和￥￥￥分別代表定量分析成本較便宜、較高、非常高。

通過數(shù)據(jù)分析對蛋白質(zhì)進行鑒定是蛋白質(zhì)組學技術(shù)的核心步驟之一。主要利用生物信息學技術(shù)，采用特定的算法，根據(jù)蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)酶解得到的多肽分子量與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，從而鑒定出樣品中的蛋白質(zhì)種類。目前，用于蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)鑒定的數(shù)據(jù)庫主要是NCBI(National Center for Biotechnology Information database)數(shù)據(jù)庫和UniProt KB(Universal Protein Knowledgebase)數(shù)據(jù)庫；用于蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)鑒定的軟件較多，較為常用的有Mascot、Protein Pilot、MaxQuant和X!Tandem等。

2 蛋白質(zhì)組學技術(shù)在肉類鑒別及肉質(zhì)分析中的應用

近年來，基于生物質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學方法得到了較快的發(fā)展，已被廣泛用于深加工肉制品中肉類的鑒別、肉質(zhì)特性(顏色、嫩度等)分析的相關(guān)研究中。而蛋白質(zhì)組學的研究結(jié)果表明，肉質(zhì)特性與其所含的蛋白質(zhì)分子密切相關(guān)。

2.1 肉類品種鑒別

蛋白質(zhì)組學技術(shù)應用于肉類品種的鑒別時，其主要研究策略為：首先提取待測肉制品所使用的原料肉中的蛋白質(zhì)，經(jīng)蛋白酶解、除雜凈化后，利用高分辨質(zhì)譜技術(shù)進行多肽鑒定(自下而上的蛋白質(zhì)組學分析方法，bottom-up strategy)，并將鑒定結(jié)果與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(如UniProt等)進行比對，篩選出具有良好穩(wěn)定性、物種特異性的1條或多條多肽標志物，然后建立上述多肽標志物的質(zhì)譜MRM定性、定量分析方法，從而實現(xiàn)對肉制品中肉類的鑒別和摻假鑒定。該方法與應用較為廣泛的PCR法相比，不僅具有良好的檢測靈敏度和特異性，還具有更為突出的優(yōu)點：多肽的穩(wěn)定性強于DNA，待檢樣品不易受到肉制品加工過程的影響；可通過多條肽段標志物進行定性、定量分析，不僅能夠保證檢測結(jié)果的準確性，且能避免出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象；樣品處理相對簡單，且MRM分析速度快、檢測通量高，可以對肉制品中多物種進行同時溯源分析和鑒定。例如，Wulff等[30]通過自下而上的蛋白質(zhì)組學分析方法，建立了22種不同種類魚肉組織的肽段質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)庫，從而通過將未知魚肉組織的肽段質(zhì)譜分析圖譜與已建立的質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)庫進行比對來實現(xiàn)鑒定魚肉種類的目的，而且該方法適用于經(jīng)過深加工的魚肉種類的鑒別。另外，Montowska等[31]利用無標記相對定量蛋白質(zhì)組學的方法建立了禽類深加工肉制品中是否摻假的判斷方法。該研究通過定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)得到了雞肉、鴨肉和鵝肉3種禽肉中具有熱穩(wěn)定性和物種特異性的20個肽段標志物，以用于3種禽肉加工產(chǎn)品中肉類的鑒定，該方法可以識別出3種禽肉混合物中摻雜低至1%的豬肉以及市售禽肉香腸中摻雜低至0.8%的牛肉蛋白，具有非常高的靈敏度。

2.2 新鮮肉與凍融肉的鑒別

肉類的儲存和加工方式會影響其肉質(zhì)的變化。冷凍一直被視作是肉類保存的最佳方法，然而，肉在冷凍的同時會伴隨著品質(zhì)的下降。這是由于冷凍時冰晶的形成會導致肉的組織結(jié)構(gòu)破壞、機械張力破壞、蛋白變性等一系列生化和物理指標的變化，因而，一般來說冷凍肉的價格會低于新鮮肉，然而，一些不法商家為了追求利益最大化會將冷凍肉融化來冒充新鮮肉進行銷售，因此，開發(fā)有效的區(qū)分新鮮肉和凍融肉的方法成為了研究熱點。Kim等[32]首次利用2D SDS-PAGE結(jié)合生物質(zhì)譜的方法對新鮮豬胸最長肌(1.0±0.5℃儲存60 h)和經(jīng)過凍融過程的豬胸最長肌(-20℃冷凍48 h后，1.0±0.5℃解凍12 h)的肉滲出液進行了差異蛋白質(zhì)組學分析。結(jié)果顯示，2種豬胸最長肌滲出液2D SDS-PAGE分別檢測到450個蛋白點，其中24個蛋白點的豐度表現(xiàn)出顯著性差異，經(jīng)質(zhì)譜分析進一步確證后，共發(fā)現(xiàn)22個可用于區(qū)分新鮮豬胸最長肌和經(jīng)過凍融過程的豬胸最長肌的潛在蛋白標志物(包括鈣網(wǎng)蛋白、脯氨酰羥化酶β亞基前體蛋白、血紅蛋白α鏈、血紅蛋白β鏈和丙酮酸激酶亞型3等)。這一研究表明差異蛋白質(zhì)組學技術(shù)的應用成功實現(xiàn)了新鮮肉和凍融肉的判別，同時也為蛋白質(zhì)組學技術(shù)用于研究其他儲存方式和加工方式對肉質(zhì)的影響奠定了理論基礎(chǔ)。

2.3 肉的嫩度

肉的嫩度、色澤和風味等均是關(guān)系到消費者滿意度的重要屬性(肉的適口性)，其中，嫩度是最重要的組成因素，同時也是不同肉類間差異最大的屬性之一。肉的嫩度通常被認為是生物體內(nèi)溶酶體酶、組織蛋白酶、鈣激活中性蛋白酶和蛋白酶體等多種內(nèi)源性蛋白酶經(jīng)過一系列的生化反應導致的肌原纖維和結(jié)締組織弱化的結(jié)果[33]。而隨著雙向電泳(2-DE)、生物質(zhì)譜和生物信息學的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)組學技術(shù)已成為闡釋肉的嫩度與α-肌動蛋白(α-actin)和肌球蛋白輕鏈-1(myosin light chain 1，MLC1)等部分結(jié)構(gòu)蛋白、熱休克蛋白27(heat shock protein，HSP27)等熱休克蛋白、脂質(zhì)抗氧化酶(peroxiredoxin-6，Prdx-6)等嫩度相關(guān)蛋白標志物之間關(guān)聯(lián)的不可或缺的研究工具[34,35]。例如，Morzel等[36]通過對屠宰后的法國布朗德·安奎坦牛的新鮮胸最長肌和老化14 d的胸最長肌進行2-DE分析，發(fā)現(xiàn)HSP27可能是與其嫩度相關(guān)的重要蛋白標志物。同樣地，Carvalho等[37]利用2-DE結(jié)合生物質(zhì)譜檢測的方法對剪切力大小不同(即嫩度不同)的2組牛肉進行分析，發(fā)現(xiàn)2組牛肉之間的蛋白質(zhì)種類和豐度均存在明顯差異。質(zhì)譜鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組不同嫩度的牛肉中的差異蛋白質(zhì)主要包括α-actin、MLC1、MLC3、MLC2F和原肌球蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白，HSPB1和HSP70等與細胞組織相關(guān)的熱休克蛋白以及β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-LG)、?；o酶A結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白6(ACBD6)等與代謝過程相關(guān)的蛋白，這一結(jié)果證明不同嫩度的牛肉中結(jié)構(gòu)蛋白含量存在顯著性差異。此外，Jia等[38]利用2-DE結(jié)合質(zhì)譜鑒定的方法對不同嫩度的牛背長肌肌肉進行了蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)過氧化物氧還酶6(peroxiredoxin 6，Prdx6)可能是影響其嫩度的潛在蛋白質(zhì)標志物。而Bjarnadóttir等[39]則通過iTRAQ同位素標記定量蛋白質(zhì)組學方法對不同嫩度的牛肉進行了分析，發(fā)現(xiàn)了3個均未被報道過的與嫩度差異相關(guān)的蛋白質(zhì)：三羧酸循環(huán)相關(guān)蛋白2(oxoglutarate dehydrogenase complex component E2)、細胞凋亡相關(guān)蛋白(galectin-1)以及控制細胞內(nèi)鈣離子釋放的蛋白(annexin A6)。另外，肉類的包裝方式和儲存時間也會影響其嫩度。Moczkowska等[40]研究發(fā)現(xiàn)，真空貼體包裝條件下的牛背最長肌的剪切力在其儲存14 d和28 d后顯著低于氣調(diào)保鮮包裝儲存條件下的牛背最長肌，同時嫩度也更佳，這是由于氣調(diào)保鮮包裝方式中氧氣的存在會促進牛背最長肌中肌球蛋白的聚合，從而使肌肉老化。盡管上述研究結(jié)果尚未完全闡明蛋白質(zhì)標志物與肉的嫩度之間的潛在分子機制，但為肉產(chǎn)業(yè)中肉質(zhì)嫩度預測和動物肉質(zhì)嫩度改良方法的研究提供了理論基礎(chǔ)。

2.4 肉色

從銷售的角度來講，肉色是影響消費者購買欲望的關(guān)鍵因素之一，消費者通常認為櫻桃紅色是新鮮、可靠的健康肉的標志，而肉色的變化會直接影響其銷售情況和價格，因此，從蛋白質(zhì)水平上開展對于不同品種或不同部位肌肉肉色差異的研究具有非常重要的意義。以往關(guān)于肉色的研究多關(guān)注于肌紅蛋白與少數(shù)小分子之間的相互作用，認為肉色變化與脂質(zhì)氧化引起的肌紅蛋白氧化密切相關(guān)。近年來，蛋白質(zhì)組學和質(zhì)譜技術(shù)開始成為研究肉色差異的潛在生化機制的高通量分析工具。Li等[41,42]發(fā)現(xiàn)綿羊肉中肌漿蛋白質(zhì)的磷酸化水平可能與其顏色的形成密切相關(guān)。實驗結(jié)果表明，綿羊肉顏色的穩(wěn)定性與肌紅蛋白的磷酸化水平呈負相關(guān)，而蛋白質(zhì)的磷酸化水平則可能通過調(diào)節(jié)肌紅蛋白的糖基化和氧化還原穩(wěn)定性來實現(xiàn)，進而影響其顏色的形成。Joseph等[43]利用無標記定量蛋白質(zhì)組學的方法對具有不同肌肉顏色穩(wěn)定性的牛背長肌肌肉(顏色穩(wěn)定)和腰大肌肌肉(顏色易變)的肌漿蛋白質(zhì)組分別進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與肌肉紅色及顏色穩(wěn)定性正相關(guān)的抗氧化蛋白、分子伴侶等蛋白質(zhì)均在背長肌肌肉中過表達，而在腰大肌肌肉中過表達的蛋白質(zhì)均與肌肉紅色呈負相關(guān)，這一結(jié)果也證實了要針對不同組織部位開發(fā)不同的牛肉處理方法以改善牛肉顏色的必要性。Yu等[44]利用無標記定量蛋白質(zhì)組學的方法闡明了荷斯坦牛肉在宰后4℃儲存過程中腰最長肌和腰大肌的顏色穩(wěn)定性。結(jié)果表明在儲存4 d和9 d后，腰最長肌比腰大肌表現(xiàn)出更好的紅色，而腰大肌中高鐵肌紅蛋白的增加比例要明顯高于腰最長肌。另外，腰最長肌和腰大肌的比較蛋白質(zhì)組學研究結(jié)果表明，大量具有抗氧化、保護和修復作用的有益于顏色穩(wěn)定的蛋白質(zhì)在腰最長肌中過表達；而大量主要參與氧化還原過程、三羧酸循環(huán)和線粒體電子傳遞過程的蛋白質(zhì)則在腰大肌中過表達，從而導致其具有較差的顏色穩(wěn)定性。這一研究從蛋白質(zhì)組學的角度闡明了牛肉組織呈現(xiàn)顏色特異性的分子機制。

綜上所述，目前鑒定到的與肉色穩(wěn)定性相關(guān)的蛋白質(zhì)標志物主要與動物宰后肉的氧化代謝過程相關(guān)，其存在能夠延遲肉類pH的下降并且減緩蛋白質(zhì)的變性，因此，上述研究為開發(fā)保持肉色的方法(抗氧化方法或包裝方式等)提供了新思路。

2.5 持水性

持水性是肉質(zhì)的一個重要特性，通常用滴水損失來評價，與動物宰后的新陳代謝變化有著密切聯(lián)系。Lawson等[45]研究表明宰后肉中整合素(integrin)蛋白的降解會導致其滴水通道的形成，即integrin降解越少，滴水損失率越小，肌肉持水力越強，因此，肉中蛋白質(zhì)的組成與變化對于肉的持水性具有重要影響。而利用差異蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究不同持水能力的肉中蛋白質(zhì)的組成與變化對于揭示與肉持水性相關(guān)的分子機制是十分必要的。研究發(fā)現(xiàn)，不同肉類的持水能力與其表達的多種代謝酶和熱休克蛋白等的含量密切相關(guān)。例如，Phongpa-Ngan等[46]對具有不同持水能力的雞肉進行了差異蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)高持水能力的雞肉與低持水能力的雞肉相比，含有5個高表達、4個低表達的蛋白點，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定后發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白質(zhì)主要包括丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶等代謝酶及熱休克蛋白等。同樣地，Di等[47]通過對不同持水能力的豬肉離心滴出液進行蛋白質(zhì)組學分析，質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，44個蛋白質(zhì)的豐度會隨著豬肉宰后時間的增加而發(fā)生變化，但這些蛋白質(zhì)中只有HSP70的豐度在低滴水損失樣品的滴出液中顯著高于其他樣品，由此推斷，在不同滴水損失的樣品中，細胞內(nèi)HSP70的含量存在明顯差異，即HSP70可能作為豬肉樣品中持水性預測的潛在標志物。Zuo等[48]通過利用2D SDS-PAGE結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行時間串聯(lián)(MALDI TOF/TOF)質(zhì)譜分析方法，分別對屠宰后0 d、1 d、7 d內(nèi)的不同持水性的牦牛背長肌進行了差異蛋白質(zhì)組學分析。結(jié)果表明，55個蛋白質(zhì)的豐度隨著宰后時間的增加發(fā)生了顯著變化，這些蛋白質(zhì)主要包括4類：代謝酶、細胞結(jié)構(gòu)蛋白、壓力相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白，其中，肌球蛋白輕鏈、熱休克蛋白27和磷酸丙糖異構(gòu)酶3個蛋白質(zhì)在高、低滴水損失率樣品中表現(xiàn)出顯著性差異，可以作為肉持水能力預測的潛在標志物。另外，生物信息學分析結(jié)果表明，這些鑒定到的蛋白質(zhì)主要參與了碳代謝、氨基酸的糖基化和生物合成等生物學過程，這一結(jié)果對于揭示與肉類持水性相關(guān)的分子機制具有重要意義。

2.6 宰后代謝機制

宰后新陳代謝一直被認為是影響肉質(zhì)變化的重要因素。研究表明，宰后肉類會發(fā)生一系列的生化反應(pH下降、滴水損失等)，這些生化反應發(fā)生的過程可能會極大地影響肉類的品質(zhì)，然而，目前宰后代謝過程中肉質(zhì)變化的相關(guān)分子機制仍不清晰?，F(xiàn)階段，蛋白質(zhì)組學技術(shù)的應用開始從分子水平上揭示宰后蛋白質(zhì)磷酸化修飾水平的變化與肉質(zhì)變化之間存在著的密切聯(lián)系。例如，Huang等[49]通過利用SDS-PAGE結(jié)合MALDI-TOF質(zhì)譜檢測的方法，研究發(fā)現(xiàn)隨著屠宰后豬背長肌放置時間的延長，肌纖維蛋白的磷酸化水平發(fā)生了明顯變化，而肌纖維蛋白磷酸化水平的變化則可能是與屠宰后發(fā)生豬肉肌肉僵直和肉質(zhì)變化關(guān)聯(lián)的直接原因。近期，Huang等[50]又利用高通量的二甲基標記定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)對屠宰24 h內(nèi)的豬背長肌肌肉的磷酸化蛋白質(zhì)組進行了分析，定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)93個磷酸化蛋白質(zhì)的184個磷酸化位點發(fā)生了顯著變化，而這些發(fā)生變化的蛋白質(zhì)的生物學功能主要是與葡萄糖的代謝以及肌肉的收縮過程相關(guān)。由此說明，由宰后豬肉的新陳代謝引起的肉質(zhì)變化與蛋白質(zhì)的磷酸化水平具有緊密的關(guān)聯(lián)。因此，蛋白質(zhì)組學技術(shù)的應用對于動物宰后新陳代謝分子機制的研究及其與宰后肉質(zhì)變化之間的關(guān)聯(lián)性研究具有重要價值。

2.7 肉質(zhì)的營養(yǎng)調(diào)控

一般來說，肉類的品質(zhì)受到遺傳、飼養(yǎng)條件(包括營養(yǎng)條件和飼養(yǎng)方式等)、屠宰和儲存條件等多種因素的影響。在動物的飼養(yǎng)過程中，可通過吸收飼料中的可消化營養(yǎng)物質(zhì)來改變機體的能量和蛋白質(zhì)的代謝水平，并最終影響動物的肉質(zhì)，因此，可以通過調(diào)整動物飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的組成(如增加脂肪、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)的含量等)和供給水平(短期禁飼等)來達到改善肉質(zhì)的目的[51～55]。目前，蛋白質(zhì)組學技術(shù)已逐漸應用于闡述膳食營養(yǎng)物質(zhì)的添加對于肉質(zhì)調(diào)控的研究中。例如，Ma等[54]研究發(fā)現(xiàn)在豬飼料中添加1%L-精氨酸，能夠在不影響其生長速度的前提下，使豬肉的肌內(nèi)脂肪含量增加約32%，同時降低其宰后48 h的滴水損失。這是由于向豬飼料中添加1%L-精氨酸會顯著影響豬肉中與能量代謝、肌纖維類型和結(jié)構(gòu)形成等相關(guān)的蛋白質(zhì)的豐度，從而使豬肉的肌內(nèi)脂肪含量增加，并達到改善肉質(zhì)的目的。另外，della Malva等[55]通過分析添加了亞麻籽和藜麥的飼料喂養(yǎng)的意大利美利奴羊的差異蛋白質(zhì)組信息，評價了飼料中亞麻籽和藜麥的添加對于羊肉嫩度的影響，研究結(jié)果顯示，添加了亞麻籽的飼料喂養(yǎng)的羊肉與普通無脂肪添加的飼料喂養(yǎng)的羊肉相比，其肌間線蛋白和肌鈣蛋白復合物等發(fā)生了顯著降解，即羊肉嫩度增加，這一結(jié)果與不同喂養(yǎng)方式下羊肉剪切力的測定結(jié)果一致(添加了亞麻籽的飼料喂養(yǎng)的羊肉剪切力最小)；而喂養(yǎng)添加了藜麥的飼料對于羊肉的嫩度的改善作用略低于添加了亞麻籽的飼料的喂養(yǎng)結(jié)果。因此，蛋白質(zhì)組學技術(shù)的應用從分子水平上闡明了動物飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的添加對于肉質(zhì)改善的作用機理。

3 展望

目前，基于2-DE和生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學技術(shù)已經(jīng)成為肉類鑒別和肉質(zhì)分析中高通量、結(jié)果可靠的強有力的分析工具。蛋白質(zhì)組學技術(shù)的發(fā)展與應用使肉的新鮮度鑒別及深加工肉制品中肉的種類鑒定成為了可能，同時在揭示肉質(zhì)特性形成的潛在分子機制方面已經(jīng)取得了一系列的進展，在一定程度上，從分子水平上闡明了蛋白質(zhì)及生物分子之間的相互作用是影響肉質(zhì)相關(guān)生化、物理化學特性的根本原因。然而，由于生物體是其基因、蛋白質(zhì)等相互作用的有機體，蛋白質(zhì)組學技術(shù)并不能完全解釋各種生物學系統(tǒng)的現(xiàn)象，因此，綜合利用系統(tǒng)生物學中多組學技術(shù)(蛋白質(zhì)組學、基因組學、翻譯后修飾組學、代謝組學等)將成為未來肉質(zhì)研究的重要方向。與此同時，基于SRM/MRM和PRM的靶向蛋白質(zhì)組學定量技術(shù)也將作為非靶向蛋白質(zhì)組學方法的補充，在肉質(zhì)分析相關(guān)的蛋白標志物的高通量驗證中發(fā)揮越來越重要的作用。

參 考 文 獻

[1] Ballin N Z. Authentication of meat and meat products[J]. Meat Sci., 2010, 86(3): 577-587.

[2] Danezis G P, Tsagkaris A S, Camin F,etal.. Food authentication: Techniques, trends & emerging approaches[J]. Trend. Anal. Chem., 2016, 85: 123-132.

[3] Abbas O, Zadravec M, Baeten V,etal.. Analytical methods used for the authentication of food of animal origin[J]. Food Chem., 2018， 246: 6-17.

[4] Di Pinto A, Bottaro M, Bonerba E,etal.. Occurrence of mislabeling in meat products using DNA-based assay[J]. J. Food Sci. Technol., 2015, 52(4): 2479-2484.

[5] 楊金寶, 何若鋼, 秦小娥, 等. 營養(yǎng)與豬肉品質(zhì)[J]. 豬業(yè)科學, 2006, 23(12):68-69.

[6] 楊建成，徐日峰，胡建民. 影響豬肉品質(zhì)因素的研究進展[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學, 2013, 52(20): 4849-4852.

[7] Pandey A, Mann M. Proteomics to study genes and genomes[J]. Nature, 2000, 405(6788): 837-846.

[8] Tonge R, Shaw J, Middleton B,etal.. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology[J]. Proteomics, 2001, 1(3): 377-396.

[9] Rabilloud T. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Old, old fashioned, but it still climbs up the mountains[J]. Proteomics, 2002, 2(1): 3-10.

[10] Cox J, Mann M. Is proteomics the new genomics?[J]. Cell, 2007, 130(3): 395-398.

[11] Aebersold R, Goodlett D R. Mass spectrometry in proteomics[J]. Chem. Rev., 2001, 101(2): 269-296.

[12] Mann M, Hendrickson R C, Pandey A. Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry[J]. Ann. Rev. Biochem., 2001, 70(1): 437-473.

[13] Arike L, Peil L. Spectral counting label-free proteomics[A]. In: Martins-de-Souza D. Shotgun Proteomics[M]. New York: Humana Press, 2014, 213-222.

[14] Han C L, Chen J S, Chan E C,etal.. An informatics-assisted label-free approach for personalized tissue membrane proteomics: Case study on colorectal cancer[J]. Mol. Cell. Proteomics, 2011, 10(4): M110.003087.

[15] Cox J, Hein M Y, Luber C A,etal.. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ[J]. Mol. Cell. Proteom., 2014, 13(9): 2513-2526.

[16] Krijgsveld J, Ketting R F, Mahmoudi T,etal.. Metabolic labeling ofC.elegansandD.melanogasterfor quantitative proteomics[J]. Nat. Biotechnol., 2003, 21(8): 927-931.

[17] Mann M. Functional and quantitative proteomics using silac [J]. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2006, 7: 952-958.

[18] Gygi S P, Rist B, Gerber S A,etal.. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags[J]. Nat. Biotechnol., 1999, 17(10): 994-999.

[19] Zieske L R. A perspective on the use of iTRAQTMreagent technology for protein complex and profiling studies[J]. J. Exp. Bot., 2006, 57(7): 1501-1508.

[20] Wiese S, Reidegeld K A, Meyer H E,etal.. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research[J]. Proteomics, 2007, 7(3): 340-350.

[21] Koehler C J, Arntzen M ?, de Souza G A,etal.. An approach for triplex-isobaric peptide termini labeling (triplex-IPTL)[J]. Anal. Chem., 2013, 85(4): 2478-2485.

[22] Koehler C J, Strozynski M, Kozielski F,etal.. Isobaric peptide termini labeling for MS/MS-based quantitative proteomics[J]. J. Proteome Res., 2009, 8(9): 4333-4341.

[23] Boersema P J, Raijmakers R, Lemeer S,etal.. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics[J]. Nat. Protoc., 2009, 4(4): 484-494.

[24] Yao X, Freas A, Ramirez J,etal.. Proteolytic18O labeling for comparative proteomics: Model studies with two serotypes of adenovirus[J]. Anal. Chem., 2001, 73(13): 2836-2842.

[25] Vidova V, Spacil Z. A review on mass spectrometry-based quantitative proteomics: Targeted and data independent acquisition[J]. Anal. Chim. Acta, 2017, 964: 7-23.

[26] Picotti P, Aebersold R. Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions[J]. Nat. Methods, 2012, 9(6): 555-566.

[27] Kitteringham N R, Jenkins R E, Lane C S,etal.. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics[J]. J. Chromatog. B, 2009, 877(13): 1229-1239.

[28] Gallien S, Kim S Y, Domon B. Large-scale targeted proteomics using internal standard triggered-parallel reaction monitoring (IS-PRM)[J]. Mol. Cell. Proteom., 2015, 14(6): 1630-1644.

[29] Peterson A C, Russell J D, Bailey D J,etal.. Parallel reaction monitoring for high resolution and high mass accuracy quantitative, targeted proteomics[J]. Mol. Cell. Proteom., 2012, 11(11): 1475-1488.

[30] Wulff T, Nielsen M E, Deelder A M,etal.. Authentication of fish products by large-scale comparison of tandem mass spectra[J]. J. Proteome Res., 2013, 12(11): 5253-5259.

[31] Montowska M, Fornal E. Label-free quantification of meat proteins for evaluation of species composition of processed meat products[J]. Food Chem., 2017, 237: 1092-1100.

[32] Kim G D, Jeong T C, Yang H S,etal.. Proteomic analysis of meat exudates to discriminate fresh and freeze-thawed porcine longissimus thoracis muscle[J]. LWT-Food Sci. Technol., 2015, 62(2): 1235-1238.

[33] Dransfield E. Optimization of tenderization, aging and tenderness [J]. Meat Sci., 1994, 36(1-2): 105-121.

[34] della Malva A, Marino R, Santillo A,etal.. Proteomic approach to investigate the impact of different dietary supplementation on lamb meat tenderness[J]. Meat Sci., 2017, 131: 74-81.

[35] Rosa A F, Moncau C T, Poleti M D,etal.. Proteome changes of beef in Nellore cattle with different genotypes for tenderness[J]. Meat Sci., 2018, 138: 1-9.

[36] Morzel M, Terlouw C, Chambon C,etal.. Muscle proteome and meat eating qualities of Longissimus thoracis of “Blonde d’Aquitaine” young bulls: A central role of HSP27 isoforms[J]. Meat Sci., 2008, 78(3): 297-304.

[37] Carvalho M E, Gasparin G, Poleti M D,etal.. Heat shock and structural proteins associated with meat tenderness in Nellore beef cattle, aBosindicusbreed[J]. Meat Sci., 2014, 96(3): 1318-1324.

[38] Jia X, Veiseth-Kent E, Grove H,etal.. Peroxiredoxin-6——A potential protein marker for meat tenderness in bovine longissimus thoracis muscle[J]. J. Anim. Sci., 2009, 87(7): 2391-2399.

[39] Bjarnadoóttir S G, Hollung K, H?y M,etal.. Changes in protein abundance between tender and tough meat from bovineLongissimusthoracismuscle assessed by isobaric tag for relative and absolute quantitation (iTRAQ) and 2-dimensional gel electrophoresis analysis[J]. J. Anim. Sci., 2012, 90(6): 2035-2043.

[40] Moczkowska M, Pótorak A, Montowska M,etal.. The effect of the packaging system and storage time on myofibrillar protein degradation and oxidation process in relation to beef tenderness [J]. Meat Sci., 2017, 130: 7-15.

[41] Li M, Li X, Xin J,etal.. Effects of protein phosphorylation on color stability of ground meat[J]. Food Chem., 2017, 219: 304-310.

[42] Li M, Li Z, Li X,etal.. Comparative profiling of sarcoplasmic phosphoproteins in ovine muscle with different color stability[J]. Food Chem., 2018, 240: 104-111.

[43] Joseph P, Suman S P, Rentfrow G,etal.. Proteomics of muscle-specific beef color stability[J]. J. Agric. Food Chem., 2012, 60(12): 3196-3203.

[44] Yu Q, Wu W, Tian X,etal.. Comparative proteomics to reveal muscle-specific beef color stability of Holstein cattle during post-mortem storage[J]. Food Chem., 2017, 229: 769-778.

[45] Lawson M A. The role of integrin degradation in post-mortem drip loss in pork[J]. Meat Sci., 2004, 68(4): 559-566.

[46] Phongpa-Ngan P, Grider A, Mulligan J H,etal.. Proteomic analysis and differential expression in protein extracted from chicken with a varying growth rate and water-holding capacity[J]. J. Agric. food Chem., 2011, 59(24): 13181-13187.

[47] Di Luca A, Mullen A M, Elia G,etal.. Centrifugal drip is an accessible source for protein indicators of pork ageing and water-holding capacity[J]. Meat Sci., 2011, 88(2): 261-270.

[48] Zuo H, Han L, Yu Q,etal.. Proteome changes on water-holding capacity of yak longissimus lumborum during postmortem aging[J]. Meat Sci., 2016, 121: 409-419.

[49] Huang H, Larsen M R, Lametsch R. Changes in phosphorylation of myofibrillar proteins during postmortem development of porcine muscle[J]. Food Chem., 2012, 134(4): 1999-2006.

[50] Huang H, Larsen M R, Palmisano G,etal.. Quantitative phosphoproteomic analysis of porcine muscle within 24 h postmortem[J]. J. Proteom., 2014, 106: 125-139.

[51] Calvo L, Toldrá F, Rodríguez A I,etal.. Effect of dietary selenium source (organic vs. mineral) and muscle pH on meat quality characteristics of pigs[J]. Food Sci. Nutr., 2017, 5(1): 94-102.

[53] Andersen H J, Oksbjerg N, Young J F,etal.. Feeding and meat quality——A future approach[J]. Meat Sci., 2005, 70(3): 543-554.

[54] Ma X, Zheng C, Hu Y,etal.. Dietary L-arginine supplementation affects the skeletal longissimus muscle proteome in finishing pigs[J]. PLoS ONE, 2015, 10(1): e0117294.

[55] della Malva A, Marino R, Santillo A,etal.. Proteomic approach to investigate the impact of different dietary supplementation on lamb meat tenderness[J]. Meat Sci., 2017, 131: 74-81.