曹 衛(wèi)，郭彥飛，黃志勇

(南京海融醫(yī)藥科技股份有限公司，江蘇 南京 211100)

甲磺酸萘莫司他(NafamostatMesilate)，化學(xué)名為對(duì)-胍基苯甲酸6-脒基-2-萘酯二甲磺酸鹽，適用于急性胰腺炎、慢性胰腺炎的急性惡化、手術(shù)后急性胰腺炎、胰管造影后的急性胰腺炎與外傷性胰腺炎急性炎癥的改善，由日本鳥居藥品株式會(huì)社研發(fā)并于1986年在日本首次上市[1]。目前該藥國(guó)內(nèi)未上市，尚處于仿制申報(bào)階段。

甲磺酸萘莫司他為甲磺酸鹽，合成過程中使用了甲醇和乙醇[2]，甲醇和乙醇易和甲磺酸鹽生成具有遺傳毒性的甲磺酸甲酯(MMS)和甲磺酸乙酯(EMS)這兩種雜質(zhì)。一些甲磺酸酯的臨床前研究發(fā)現(xiàn)這些甲磺酸酯可直接與生物大分子(DNAs，RNAs和蛋白質(zhì))發(fā)生烷基化反應(yīng)，可能會(huì)導(dǎo)致DNA突變，致癌效應(yīng)和致畸效應(yīng)[3]。近年來，歐洲藥物管理局(EMEA)和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)陸續(xù)發(fā)布了遺傳毒性雜質(zhì)控制的相關(guān)法規(guī)，提出了采用“毒理學(xué)關(guān)注閾值”(Threshold of Toxicological Concern，TTC)[4-5]，具體含義為：一個(gè)“1.5μg/d”的TTC值，即相當(dāng)于每天攝入1.5μg的基因毒性雜質(zhì)，被認(rèn)為對(duì)于大多數(shù)藥品來說是可以接受的風(fēng)險(xiǎn)(一生中致癌的風(fēng)險(xiǎn)小于十萬分之一)，按照這個(gè)閥值，可以根據(jù)預(yù)期的每日攝入量計(jì)算出活性藥物中可接受的雜質(zhì)水平。

因甲磺酸酯類的雜質(zhì)限度要求較低，通常的色譜分析方法會(huì)面臨檢測(cè)靈敏度不夠、樣品基質(zhì)干擾以及樣品中的甲磺酸與醇類流動(dòng)相反應(yīng)生成磺酸酯干擾測(cè)定等問題，故本次實(shí)驗(yàn)筆者參考《歐洲藥典》EP9.0中關(guān)于甲磺酸鹽中對(duì)甲磺酸甲酯、乙酯的測(cè)定方法(2.5.37.Methy，Ethyl and Isopropyl Methanesulfonate in Methanesulfonic Acid[6])，采用二氯甲烷萃取技術(shù)與GC-MS聯(lián)用，對(duì)上述兩種物質(zhì)進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

GC-MS2010plus氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，日本Shimadzu公司；BT125D分析天平，德國(guó)賽多利斯公司；HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25μm)，美國(guó)安捷倫公司；甲磺酸甲酯(批號(hào)：LS20P45，純度99%)，甲磺酸乙酯(批號(hào)：L680O91，純度98.5%)，甲磺酸異丙酯(批號(hào)：LC30P16，純度97%)，北京百靈威科技有限公司；色譜級(jí)二氯甲烷；分析級(jí)無水硫酸鈉；甲磺酸萘莫司他原料(批號(hào)：170401、170402、170403)，南京海融醫(yī)藥科技股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

內(nèi)標(biāo)溶液：稱取甲磺酸異丙酯約12.5 mg，置50 mL量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，取該溶液1.0 mL，置100 mL量瓶中，二氯甲烷稀釋至刻度(2.5μg/mL)，取該溶液10.0 mL，置100 mL量瓶中，二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：精密稱取樣品0.2 g，加2 mL水溶解后，加2 mL內(nèi)標(biāo)溶液提取，分離和轉(zhuǎn)移有機(jī)層至約含0.2g無水硫酸鈉的小瓶中，過濾，取續(xù)濾液，即得。

對(duì)照品溶液：精密稱取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯各約12.5 mg，分別置50 mL量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度(250μg/mL)，取該溶液1.0 mL，分別置100 mL量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度(2.5μg/mL)，分別取上述兩溶液1.0 mL和濃度為2.5μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液1.0 mL，置同一10 mL量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

定位溶液：分別取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯濃度均為2.5μg/mL的溶液各1 mL，分別置10 mL量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，作為定位溶液。

2.2 色譜條件

色譜條件：載氣為高純氦氣；柱流量：1.5 mL/min；分流比為2∶1；進(jìn)樣量1μL；采用程序升溫，起始柱溫45℃，保持1min，再以10℃/min，升到135℃，維持2min；進(jìn)樣口溫度為240℃。

質(zhì)譜條件：離子源溫度為230℃；接口溫度為260℃；溶劑延遲時(shí)間：2.5min；檢測(cè)器電壓：調(diào)諧電壓；電子能量：70eV；掃描(檢測(cè))方式：選擇性離子檢測(cè)(SIM)。甲磺酸甲酯、乙酯、異丙酯m/z的為80、79和123。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取空白溶液(二氯甲烷)和“2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液各1.0μL注入氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下的GC-MS條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，結(jié)果各雜質(zhì)峰分離均大于1.5，空白溶劑不干擾測(cè)定。對(duì)照品色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品溶液色譜圖

2.4 線性試驗(yàn)

精密稱取甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯各適量，加二氯甲烷溶解并稀釋制成每1mL中各約含0.5μg/mL的溶液，作為混合對(duì)照品溶液；精密量取混合對(duì)照品溶液0.2、0.5、1.0、3.0、5、8mL分別置10mL量瓶中，各加濃度為2.5μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液1mL后，用二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，制得濃度分別為0.01、0.025、0.05、0.15、0.25、0.4μg/mL的溶液，作為線性考察溶液(1)～(6)；取溶液(1)～(6)，按“2.2”項(xiàng)下的GC-MS條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖。以各成分的濃度為橫坐標(biāo)，雜質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得甲磺酸甲酯的回歸方程為y=3.4022x-0.0065(r=0.9999)，甲磺酸乙酯的回歸方程為y=3.2865x+0.0025(r=0.9999)。結(jié)果表明，甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯在0.01～0.4μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下的線性考察溶液(5)1.0μL，照“2.2”項(xiàng)下的GC-MS條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，結(jié)果，甲磺酸甲酯峰與甲磺酸異丙酯(內(nèi)標(biāo))峰面積比的RSD為1.3%，甲磺酸乙酯峰與甲磺酸異丙酯(內(nèi)標(biāo))峰面積比的RSD為3.7%，表明儀器精密度良好。

2.6 檢測(cè)限與定量限試驗(yàn)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度峰的信號(hào)，取“2.1”項(xiàng)下各定位溶液，用二氯甲烷逐級(jí)稀釋后，照“2.2”項(xiàng)下的GC-MS條件進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)得各雜質(zhì)的檢測(cè)限(S/N≥3)和定量限(S/N≥10)。結(jié)果，甲磺酸甲酯與甲磺酸乙酯的檢測(cè)限分別為5 ng/mL和3ng/mL，定量限分別為14.8ng/mL和7.5ng/mL。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取原料(批號(hào)170401)0.2g，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下供試品溶液配置方法進(jìn)行配制，共配制6份，照“2.2”項(xiàng)下的GC-MS條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，結(jié)果，樣品中均未檢測(cè)出甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取濃度為25μg/mL的甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯溶液各0.8mL置同一100mL量瓶中，加入25μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液1.0mL，在室溫下?lián)]去二氯甲烷后，用水溶解并稀釋至刻度，得80%回收率儲(chǔ)備液；另同法制備100%和120%的回收率儲(chǔ)備液。取原料(批號(hào)170401)0.2g，9份，精密稱定，分別加入80%、100%、120%回收率貯備液各2 mL(各三份)，超聲使溶解，加2 mL二氯甲烷萃取，取下層有機(jī)相，各加入約0.2g的無水硫酸鈉，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，照“2.2”項(xiàng)下的GC-MS條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，結(jié)果，甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的平均回收率(n=3)分別為90.2%和97.0%，RSD分別為1.5%和6.1%。表明該方法回收率良好。

2.9 樣品測(cè)定

取3批原料各適量，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下供試品溶液配置方法進(jìn)行配制，照“2.2”項(xiàng)下的GC-MS條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，結(jié)果，3批樣品均未檢出甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯。

3 討論

3.1 限度的確定

甲磺酸萘莫司他的每日最大日使用量為600 mg，按TTC值為1.5μg/d，用1.5μg除以日最大劑量600 mg，即甲磺酸萘莫司中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯不得過2.5μg/g，按此限度進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，本試驗(yàn)的限度保證了甲磺酸萘莫司他的用藥安全。

3.2 氣相色譜條件的選擇與優(yōu)化

因本品配制過程中需要用到提取分離，為消除由操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，固在檢測(cè)過程中加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，EP9.0中關(guān)于甲磺酸鹽中對(duì)甲磺酸甲酯、乙酯、異丙酯的測(cè)定方法中采用甲磺酸丁酯作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，因本品工藝過程中未使用異丙酯，固本次實(shí)驗(yàn)將甲磺酸異丙酯作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

由于甲磺酸萘莫司他在水中易溶，因此采用水使樣品溶解后，再用含甲磺酸異丙酯的二氯甲烷溶液將樣品中存在的甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯提取出來。

圖2 二氯甲烷干擾色譜圖

參照EP9.0中關(guān)于甲磺酸鹽中對(duì)甲磺酸甲酯、乙酯、異丙酯的測(cè)定方法，升溫程序?yàn)槠鹗贾鶞?5℃，保持1min，再以10℃/min，升到135℃，維持2min；進(jìn)樣口溫度為240℃時(shí)，各雜質(zhì)峰分離均較好，但二氯甲烷對(duì)甲磺酸乙酯有干擾，色譜圖見圖2。故在此升溫程序的基礎(chǔ)上微調(diào)升溫程序，最終溶劑峰不干擾雜質(zhì)檢測(cè)，各峰之間分離度均大于1.5。

參考文獻(xiàn)

[1] 陸美貞.抗胰腺炎藥甲磺酸萘莫司他[J].國(guó)外藥學(xué)—合成藥、生化藥、制劑分冊(cè)，1988，9(4)：234-235.

[2]陳寶泉，趙煜松，歐陽杰，等.甲磺酸萘莫司他的合成[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38(8)：545.

[3] Benigni R,Bossa C.Chanisms of Chemical carcinogenicity and mutagenicity:a review with implications for predictive toxicology[J].Chem Rev，2011，111( 4) :2507-2536.

[4]EMEA.Guidelines on the limits of genotoxic impurities[S].London:EMEA,2006.

[5]FDA.Guidance for industry: Genotoxic and carcinogenicimpurities in drug substances and products: recommended approaches[S].US:FDA,2008.

[6]European Pharmacopoeia 9.0，2.5.37.Methyl，ethyl and isopropyl methanesulfonate in methanesulfonic acid[S].EDQM,2017:176-177.