陳 驀， 王 武，李永東， 李明華

Willis環(huán)由兩側(cè)大腦前動(dòng)脈起始段、兩側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈末端、兩側(cè)大腦后動(dòng)脈借前、后交通動(dòng)脈連通而成，其作用是調(diào)節(jié)血液分配，維持腦營(yíng)養(yǎng)和功能活動(dòng)。Willis環(huán)是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤和腦缺血好發(fā)部位，顱內(nèi)動(dòng)脈瘤尤其好發(fā)于Willis環(huán)動(dòng)脈分叉部［1］。小鼠因體型小、便于操作、價(jià)格便宜、轉(zhuǎn)基因種系多等優(yōu)勢(shì)常用于腦動(dòng)脈瘤、腦缺血、阿爾茲海默癥等［2-5］模型的Willis環(huán)建模。通過小鼠Willis環(huán)灌注成像了解其完整結(jié)構(gòu)，可為小鼠腦動(dòng)脈瘤和腦缺血模型提供有效的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。目前Willis環(huán)灌注方法多通過小鼠心尖處（左心室）進(jìn)行心臟灌注，應(yīng)用不同灌注劑（混合或不混合染液），最后取腦觀察Willis環(huán)。這些方法雖可觀察到Willis環(huán)結(jié)構(gòu)，但多不完整或充盈不良，對(duì)微小腦動(dòng)脈瘤就更難以清晰顯示。為解決這些問題，本實(shí)驗(yàn)通過小鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈灌注對(duì)比劑Microfil顯示W(wǎng)illis環(huán)，旨在評(píng)價(jià)其成像可行性和效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)C57BL/6小鼠20只（雄性，約14周齡，重約20 g）。本實(shí)驗(yàn)設(shè)施環(huán)境條件符合中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施》（GB14925-2001）對(duì)屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物飼養(yǎng)管理和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合《上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》等法規(guī)要求。所有小鼠經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室飲食喂養(yǎng)。研究時(shí)間為2016年3月至2017年6月。

1.2 方法

小鼠肌內(nèi)注射肝素（500 U/kg），30 min后肌內(nèi)注射氯氨酮稀釋液（1∶4）0.2 mL作麻醉；固定小鼠后解剖胸腔，依次自心尖灌注37℃0.9%氯化鈉溶液10 mL、4%多聚甲醛溶液和2%戊二醛溶液混合液（1∶1）15 mL；顯微鏡下分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，將24 g留置針從心尖插入右側(cè)頸總動(dòng)脈起始部或中段，連接注射器后30 min內(nèi)勻速緩慢推注Microfil（MV-130∶稀釋劑 ∶硬化劑＝4∶5∶0.45）5 mL， 灌注操作示意圖見圖1；灌注后小鼠4℃過夜，從面部分離顱底骨后取腦，浸入4%甲醛中2～3 d，Stemi 508型和Axiocam 506 color型體視鏡（德國(guó)Carl Zeiss公司）下觀察。

1.3 評(píng)價(jià)

圖1 小鼠灌注操作示意圖

將體視鏡下觀察到的Willis環(huán)定義為3種狀況：①完全充盈，即所有血管包括雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈和大腦前動(dòng)脈充盈良好、灌注清晰，立體感強(qiáng)；②大部分充盈，即部分血管充盈良好、灌注清晰；③充盈不良，即僅有少部分血管充盈良好。

2 結(jié)果

通過小鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈途徑Microfil灌注Willis環(huán)成像技術(shù)建立的小鼠Willis環(huán)形態(tài)結(jié)構(gòu)見圖2。20只實(shí)驗(yàn)小鼠全部灌注成功，總灌注成功率為100%。其中完全充盈11只（55%），大部分充盈4只（20%），充盈不良5只（25%）。大體觀察小鼠灌注后Willis環(huán)完整，染色血管顯示清晰；體視鏡下觀察小鼠Willis環(huán)清晰、充盈、立體。

3 討論

圖2 小鼠Willis環(huán)形態(tài)結(jié)構(gòu)

相比大型動(dòng)物，小型動(dòng)物（如鼠科、兔等）更常用于動(dòng)脈瘤和腦缺血建模試驗(yàn)［6］。其中鼠科動(dòng)物體型小、價(jià)格便宜，且因轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展有著廣泛種系，可進(jìn)行復(fù)雜分子和細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)［7］，故最常用于動(dòng)脈瘤和腦缺血實(shí)驗(yàn)研究，而小鼠Willis環(huán)灌注常作為實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)一部分。

小鼠Willis環(huán)灌注前試驗(yàn)已有學(xué)者報(bào)道，但方法與本研究有所不同。Lee等［8］對(duì)小鼠皮下注射肝素再麻醉30 min后，先灌注溫0.9%氯化鈉溶液和2%戊二醛，再以持續(xù)100 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）壓力向左心室灌注多聚甲醛固定血管，腦充盈后在55℃恒溫箱過夜聚合，再浸入15%氫氧化鉀溶液腐蝕，流水沖洗，浸入5%蟻酸15 min，冷凍干燥機(jī)中脫水48 h；脫水樣本覆蓋上離子涂層后于掃描電鏡（韓國(guó)COXEM公司）下觀察。此方法可觀察到清晰的動(dòng)脈圖像，但灌注方法操作復(fù)雜，處理時(shí)間長(zhǎng)，腐蝕劑存在一定危險(xiǎn)性，且未經(jīng)染色，觀察效果欠佳。李廣意等［9］在實(shí)驗(yàn)小鼠麻醉后，體視顯微鏡下向左心室灌注填充劑（過氯乙稀10 g、乙酸乙脂90 mL、鄰苯二甲丁2.7 mL和紅色油料適量按比例配制），再將小鼠頭部分離并浸于鹽酸，對(duì)顱骨進(jìn)行腐蝕軟化；待顱骨軟化后用手術(shù)器械剝離，于體視鏡下觀察。此方法優(yōu)點(diǎn)是所取Willis環(huán)完整，缺點(diǎn)是取腦操作復(fù)雜，需要鹽酸反復(fù)腐蝕小鼠顱骨，還要再用器械修飾。Sugiyama等［10］在小鼠麻醉后左心室插管，先后注射0.9%氯化鈉溶液2 mL和預(yù)先混有Mogul L碳黑50 μL的乳膠復(fù)合物0.5 mL進(jìn)行灌注。

通過左心室進(jìn)行心臟灌注，Willis環(huán)不易完全充盈。為解決這一問題，本實(shí)驗(yàn)在保留前實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)基礎(chǔ)上對(duì)某些步驟加以改進(jìn)。首先，與之前學(xué)者研究的通過心尖-左心室-主動(dòng)脈弓-頭臂干-右側(cè)頸總動(dòng)脈-右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈-Willis環(huán)行心臟灌注途徑不同，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈-右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈-Willis環(huán)途徑灌注，省去了心尖-左心室-主動(dòng)脈弓-頭臂干這一中間環(huán)節(jié)，使得灌注血管充盈度更好，Willis環(huán)動(dòng)脈顯像更加具有立體感。相比于其它研究者灌注后易于觀察Willis環(huán)血管外徑，本實(shí)驗(yàn)灌注后更易于觀察Willis環(huán)血管內(nèi)徑，達(dá)到MRA觀察效果。其次，本實(shí)驗(yàn)選擇Microfil對(duì)比劑進(jìn)行小鼠Willis環(huán)灌注。Microfil是由MV染劑、稀釋劑、硬化劑按一定比例混合而成的復(fù)合物。在生理注射壓力下灌注Microfil即能充滿小鼠微血管，并使其不透明；Microfil具有微小收縮性，可完全填充血管，提高血管灌注連續(xù)性，保證灌注后微循環(huán)在觀察時(shí)清晰生動(dòng)；經(jīng)Microfil灌注的組織顏色具有多樣化，便于顯微檢查和攝片［11］。再次，小鼠經(jīng)灌注后從面部分離顱底骨取腦，無需腐蝕取腦。經(jīng)過改進(jìn)后，操作步驟得以簡(jiǎn)化且更安全，試驗(yàn)用時(shí)相應(yīng)縮短。

實(shí)施本實(shí)驗(yàn)需注意：①M(fèi)icrofil濃度配比。硬化劑濃度過高可能在未完全灌注前Microfil先凝固，不能完成灌注，濃度過低則長(zhǎng)時(shí)間灌注也不凝固，導(dǎo)致血管充盈不充分。②0.9%氯化鈉溶液和固定劑推速可相對(duì)較快。Microfil灌注速度應(yīng)緩慢勻速，流量過快可能造成小血管破裂，Willis環(huán)得不到完全灌注。但應(yīng)注意Microfil要在30 min內(nèi)灌注完成。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)論認(rèn)為，通過小鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈途徑灌注Microfil顯示W(wǎng)illis環(huán)方法簡(jiǎn)單、可行，不僅能使小鼠Willis環(huán)充盈良好，還能清晰顯示其立體結(jié)構(gòu)，具有MRA成像效果。

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