杜 楠，王 璐，白 鴿，張明星，肖婭萍,張 坤，王 攀，王筱冰，劉全宏1,

(1藥用植物資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，陜西 西安 710062;2西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，陜西 西安 710062;3陜西師范大學 生命科學院，陜西 西安 710062)

絞股藍(Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino)為葫蘆科(Cucurbitaceae)絞股藍屬多年生草質(zhì)藤本植物，又名五葉參、七葉參等。絞股藍是除五加科人參屬植物以外唯一含有人參皂苷的植物，且較人參更易栽培，優(yōu)良品種中人參皂苷的含量甚至高于人參，因此獲得了“南方人參”的美譽[1]。絞股藍屬于雌雄異株，自然條件下結(jié)種量較小，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，絞股藍主要依靠根狀莖來繁殖。而對于絞股藍種子，一方面尚未引起人們的充分重視而研究甚少；另一方面其通常只用于有性繁殖，或廢棄而未得到充分利用。絞股藍籽油是從藥用植物絞股藍種子中提取獲得的天然植物油脂，其中含有超過80%的多不飽和脂肪酸及多種植物甾醇，具有作為食品添加劑、保健食品及藥品原料的開發(fā)潛力[2]。Wang等[2-3]通過超臨界CO2法萃取絞股藍籽油，并對絞股藍籽油的油脂成分進行了分析和抗氧化研究，但絞股藍籽油要開發(fā)為一種新的食品資源，尚必須進行食品安全毒理學評價，而相關(guān)研究尚未見報道。

衰老又稱老化，是機體退化時期生理紊亂及功能下降的一個不可逆的過程，也是一種自然而復雜的生物學過程。進入21世紀后，全球開始跨入一個人口老齡化社會。隨著2025年人口老齡化高峰期的到來，研究衰老及抗衰老已刻不容緩。D-半乳糖致小鼠衰老模型，主要原理是通過在一定時間內(nèi)連續(xù)注射D-半乳糖，增高機體細胞的半乳糖濃度，并在醛糖還原酶催化作用下將D-半乳糖還原成半乳糖醇，由于機體不能正常代謝該物質(zhì)，于是這一物質(zhì)便堆積在細胞中使細胞的正常滲透壓受到影響，導致細胞腫脹、代謝紊亂和功能障礙，最終導致機體衰老[4-10]。

本研究以急性經(jīng)口毒性試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗來評價絞股藍籽油的食品安全性，并通過頸背部皮下注射D-半乳糖建立小鼠衰老模型，檢測血清和組織中的生理生化指標，觀察小鼠肝組織切片，研究絞股藍籽油的抗衰老作用，以期為絞股藍籽油的生物學功能研究及其新資源的開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

絞股藍籽油經(jīng)超臨界CO2萃取制備。試驗動物為健康昆明種小鼠，購買于安徽醫(yī)科大學動物實驗中心。

1.2 試劑與儀器

主要試劑有：注射用環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；Giemsa染色液，北京雷根生物技術(shù)有限公司；D-半乳糖，美國Sigma公司；無水乙醇、石蠟、二甲苯、氯化鈉、鹽酸、蘇木精、伊紅、多聚甲醛、中性樹膠、抗壞血酸(VC)，均購自天津市天力化學試劑有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、低密度脂蛋白(LDL)試劑盒、高密度脂蛋白(HDL)試劑盒，均購自吉林長春匯力生物技術(shù)有限公司。

主要儀器設(shè)備有：可拍照光學顯微鏡(P95-C MOTIC2506)，德國Zeiss公司；HH-6B型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇常州國華電器有限公司；SL202型藥物電子天平，上海明橋精密科學儀器有限公司；H-1型漩渦混勻器，上?？岛坦怆妰x器有限公司；JB-3型磁力攪拌器，杭州儀表機電有限公司；TGL-20bR型高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；KD-1508A型輪轉(zhuǎn)式切片機，浙江金華儀器有限公司；Nikon E2000型光學顯微鏡，Nikon公司；Epoch超微量微孔板分光光度計，美國BioTek公司；動物手術(shù)器械，廣東醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗 選用健康昆明種小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)2～3 d后隨機分為空白對照組和高、中、低劑量組，每組10只，雌雄各半，在相同條件下分籠飼養(yǎng)。灌胃絞股藍籽油前禁食16 h左右，空白對照組灌胃生理鹽水，劑量為10.0 g/kg;絞股藍籽油高(GPSO-H)、中(GPSO-M)、低(GPSO-L)劑量組灌胃劑量分別設(shè)置為4.6，10.0及21.5 g/kg，經(jīng)口進行一次性灌胃后，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠的飲食、運動、排泄、中毒表現(xiàn)及死亡情況。測定經(jīng)口半數(shù)致死劑量(LD50)，若劑量超過10.0 g/kg仍不能引起動物死亡，初步認定受試樣品無毒或低毒。

1.3.2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗 選用健康昆明種小鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，隨機分為空白對照組、陽性對照組和高、中、低劑量組，每組10只，雌雄各半?？瞻讓φ战M灌胃生理鹽水，劑量為10.0 g/kg;陽性對照組用環(huán)磷酰胺(CTX，40 mg/kg)進行腹腔注射，每天1次，連續(xù)5 d;絞股藍籽油高(GPSO-H)、中(GPSO-M)、低(GPSO-L)劑量組以2.5，5.0及10.0 g/kg的灌胃劑量連續(xù)灌胃絞股藍籽油5 d，每天1次，最后1次灌胃后24 h處死小鼠，取股骨骨髓，制作骨髓細胞涂片，甲醇固定15 min，Giemsa染色10～15 min，雙盲法鏡檢，每只小鼠計數(shù)1 000個嗜多染紅細胞(Polychromatic erythrocyte，PCE)中含微核的PCE數(shù)，并計數(shù)200個細胞中PCE與正染紅細胞(Normochromatic erythrocyte，NCE)的比值，微核發(fā)生率以千分率(‰)表示[11-12]。

1.3.3 小鼠精子畸形試驗 選用體質(zhì)量30～35 g的性成熟昆明種雄性小鼠25 只，隨機分為空白對照組、陽性對照組和絞股藍籽油高、中、低劑量組，每組5只，以腹腔注射40 mg/kg的環(huán)磷酰胺為陽性對照，每天1次，連續(xù)5 d，絞股藍籽油低、中、高組以2.5,5.0及10.0 g/kg的灌胃劑量連續(xù)灌胃絞股藍籽油5 d，最后1次灌胃7，14，21，28，35 d后分別處死小鼠，取兩側(cè)附睪剪碎，制備精子涂片，甲醇固定，質(zhì)量分數(shù)1%伊紅染色10 min，油鏡下觀察，每只小鼠計數(shù)1000個結(jié)構(gòu)完整的精子細胞，依據(jù)精子畸變分型，統(tǒng)計每1 000個結(jié)構(gòu)完整的精子細胞中畸變精子的數(shù)量，計算精子畸形率，以千分率(‰)表示[13]。

1.3.4 抗衰老研究 將雌性昆明小鼠飼養(yǎng)在通風良好、濕度和溫度均適宜的環(huán)境中，自由攝食和飲水，期間觀察小鼠狀態(tài)，適應(yīng)性飼養(yǎng)2～3 d后進行后續(xù)試驗。將每只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后稱質(zhì)量,隨機分成6組，即空白對照組、衰老模型組、陽性對照組和絞股藍籽油低(GPSO-L)、中(GPSO-M)、(GPSO-H)劑量組，每組10只。其中空白對照組每天頸背部皮下注射400 mg/kg生理鹽水，其余各組每天頸背部皮下注射D-半乳糖400 mg/kg。衰老模型組和空白對照組每天灌胃4 mL/kg的生理鹽水，陽性對照組每天灌胃100 mg/kg的抗壞血酸(VC)，絞股藍籽油低、中、高劑量組分別按2.0，3.0和4.0 mL/kg劑量每天灌胃絞股藍籽油，連續(xù)給藥60 d。在試驗過程中小鼠正常飼養(yǎng)，每7 d稱量記錄體質(zhì)量1次，并觀察小鼠狀態(tài)。在末次給藥后，所有小鼠禁食不禁水12 h后頸椎脫臼法處死，試劑盒測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)濃度及肝、腦組織超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量等各項生理生化指標[9]。

1.3.5 臟器指數(shù) 將所有小鼠稱質(zhì)量后處死，取出胸腺、肝臟、脾臟、腎臟以及腦組織分別稱質(zhì)量，計算各臟器指數(shù)。計算公式如下：

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.3.6 測試樣品的制備 (1)血清。各組小鼠末次給藥禁食12 h后，眼眶取血，將采集的血液在3 000 r/min下低溫離心10 min，取上層血清保存于-20 ℃冰箱中待測。(2)組織勻漿的制備。取出各組小鼠腦和肝組織后，冰浴生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，稱取1.0 g組織置于研缽中，在低溫條件下加入冰浴生理鹽水9 mL研磨成體積分數(shù)10%的組織勻漿液，在3 000 r/min下低溫離心10 min，取上清液保存于-20 ℃冰箱中待測。

1.3.7 肝臟組織病理學石蠟切片的制作 每組隨機取3塊肝臟，在肝小葉部分剪取5 mm×5 mm的方塊，用于石蠟切片的制作。制作流程如下：固定(體積分數(shù)10%福爾馬林)→脫水(體積分數(shù)50%～100%乙醇梯度脫水)→透明(二甲苯)→包埋(軟蠟，硬蠟)→切片→脫蠟(二甲苯)→染色(H&E)→封片(中性樹脂)→鏡檢。

(1)透明。取出在福爾林固定液中固定24 h的小鼠肝臟組織塊，流水沖洗，用體積分數(shù)50%～100%的乙醇梯度洗脫，逐漸脫去組織中的水分，然后用二甲苯逐步透明。以上每步均進行30 min。

(2)石蠟包埋。將已透明的肝臟組織塊，按組別分別轉(zhuǎn)置于盛有已熬好軟蠟的蠟杯中，放入60 ℃保溫箱內(nèi)，待石蠟完全浸入組織塊后，用硬蠟進行包埋。

(3)切片。將包埋好組織的蠟塊修好后，用切片機連續(xù)切片，其厚度為6 μm，附于用固定液處理好的載玻片上進行貼片，40 ℃恒溫烘干。

(4)H&E染色。二甲苯脫去切片中的石蠟，體積分數(shù)100%～50%乙醇梯度脫水，蒸餾水水洗，以上每步均進行5 min。然后蘇木精染色4 min，自來水沖洗至泛藍色，鹽酸酒精分色2～5 s，體積分數(shù)50%～90%乙醇梯度脫水，伊紅染色4 min，二甲苯透明，中性樹脂封片成永久切片。

(5)鏡檢。在光學顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理學變化，拍攝并保存照片。

1.3.8 血清及腦、肝組織生理生化指標的檢測 按照試劑盒使用說明書測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)濃度及肝、腦組織超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量等指標。每個樣品均重復3次，以降低誤差確保試驗結(jié)果的準確性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPAA20.0分析軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗方差分析及多重比較，差異顯著性用P<0.05或P<0.01表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗

急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果表明，在空腹灌胃4.6，10 .0和21.5 g/kg絞股藍籽油4 h后，各劑量組小鼠均未見明顯的中毒癥狀，常規(guī)飼養(yǎng)14 d內(nèi)小鼠生長發(fā)育正常，毛色光澤良好，飲食、運動、排泄均未見異常現(xiàn)象，無小鼠死亡。試驗期間受試動物均未見明顯中毒反應(yīng)且無動物死亡，表明絞股藍籽油對雌雄小鼠急性經(jīng)口LD50值均大于10.0 g/kg，依據(jù)急性毒性劑量分級標準屬于實際無毒物質(zhì)，可進入下一階段毒理學試驗。

2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗

空白對照組、陽性對照組及絞股藍籽油低、中、高劑量組小鼠骨髓嗜多染紅細胞的統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

表1 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結(jié)果Table 1 Effect of GPSO on microkernel rate of polychromatic erythrocytes in mice

注：**表示與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01)。表2同。

Note：** means highly significant difference compared with control group(P<0.01).The same for Table 2.

表1結(jié)果表明，絞股藍籽油低、中、高3個劑量組雌雄小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核發(fā)生率為2.0‰～3.8‰，與空白對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)，亦無劑量依賴效應(yīng)；但陽性對照組雌、雄小鼠骨髓嗜多染細胞的微核發(fā)生率達到31.2‰和39.4‰，與其他組相比均有極顯著差異(P<0.01)。說明在本試驗劑量范圍內(nèi)，絞股藍籽油不會對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核數(shù)造成顯著影響，即受試樣品的微核試驗結(jié)果為陰性。

2.3 精子畸形試驗

絞股藍籽油對小鼠精子畸形率的影響如表2所示。與骨髓細胞微核試驗結(jié)果相似，陽性藥物處理后，小鼠精子的畸形率為6.52‰，極顯著高于空白對照組及其他各劑量組(P<0.01)，而絞股藍籽油低、中、高劑量組小鼠精子畸形率分別為2.24‰，1.82‰和2.02‰，與空白對照組相比無顯著差異(P>0.05)，表明絞股藍籽油對小鼠精子無致畸變作用，試驗結(jié)果為陰性。

表2 小鼠精子畸形試驗結(jié)果Table 2 Effect of GPSO on sperm abnormality rate in mice

2.4 絞股藍籽油對D-半乳糖致衰老小鼠體質(zhì)量的影響

絞股藍籽油對各試驗組小鼠體質(zhì)量的影響如表3所示。由表3可知，在試驗開始后的49 d內(nèi)，各試驗組小鼠體質(zhì)量總體上呈持續(xù)增長趨勢，但增長幅度整體較小。總體上看，衰老模型組小鼠體質(zhì)量增長最為緩慢，在42 d后其體質(zhì)量一直呈下降趨勢，試驗結(jié)束時該組小鼠體質(zhì)量最低。在56 d時，所有小鼠體質(zhì)量都有所下降，可能是處死之前斷食所致。

表3 絞股藍籽油對D-半乳糖致衰老小鼠體質(zhì)量的影響Table 3 Effect of GPSO on body weight of aging g

注：與空白組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；與衰老模型組相比, #表示差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note：*means significant difference compared with control group (P<0.05),**means highly significant difference compared with control group(P<0.01)；#means significant difference compared with aging model group(P<0.05),##means highly significant difference compared with aging model group(P<0.01).The same below.

與空白對照組相比，衰老模型組小鼠在試驗第42天時體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)，在第21，49，56天時體質(zhì)量極顯著降低(P<0.01)。而絞股藍籽油低、中、高劑量組中，除絞股藍籽油中劑量組在21和49 d表現(xiàn)出顯著性差異外，其余各組均無明顯差異(P>0.05)。絞股藍籽油低、中、高劑量組與衰老模型組相比，除高劑量組在56 d時無顯著差異外，低、中劑量組在49,56 d均表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)，并且絞股藍籽油低劑量組在14～28 d時有顯著差異，高劑量組在第21天有顯著差異。與衰老模型組相比，陽性對照組在第35天開始呈現(xiàn)顯著性差異，在最后1周時呈現(xiàn)極顯著差異。

表3結(jié)果說明，D-半乳糖對小鼠食欲及吸食能力有一定影響，使其體質(zhì)量增加緩慢，而絞股藍籽油低、中、高劑量組緩解了這一癥狀，即絞股藍籽油可以改善D-半乳糖致衰老小鼠食欲及吸食能力的不斷下降，具有一定的抗衰老活性。

2.5 絞股藍籽油對D-半乳糖致衰老小鼠臟器指數(shù)的影響

D-半乳糖致衰老小鼠處死后，其肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、腎臟指數(shù)的計算結(jié)果見表4。

表4 絞股藍籽油對D-半乳糖致衰老小鼠臟器指數(shù)的影響Table 4 Effect of GPSO on spleen index of aging

由表4可知，與空白對照組相比，衰老模型組小鼠肝臟指數(shù)極顯著減低(P<0.01)，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低(P<0.05)；與衰老模型組相比，陽性對照組小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)有顯著差異(P<0.05)，絞股藍籽油低、中、高劑量組小鼠的肝臟指數(shù)均有顯著差異(P<0.05)，中劑量組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)也有顯著差異(P<0.05)。

臟器指數(shù)可反映動物的健康狀況。對于脾臟指數(shù)而言，絞股藍籽油低、中、高劑量組小鼠與衰老模型組小鼠相比均呈升高趨勢，說明灌胃絞股藍籽油可使小鼠脾臟趨于正常，增強小鼠免疫功能。對于胸腺指數(shù)而言，絞股藍籽油低、中、高劑量組小鼠與衰老模型組小鼠相比均呈現(xiàn)升高趨勢，說明灌胃不同劑量絞股藍籽油均能提高小鼠胸腺的生理機能，從而達到增強小鼠免疫功能的目的。對于腎臟指數(shù)而言，各組小鼠均無明顯差異(P>0.05)，說明陽性對照組和灌胃絞股藍籽油對小鼠腎臟無明顯影響。

2.6 絞股藍籽油對D-半乳糖致衰老小鼠血清生化指標的影響

對D-半乳糖致衰老小鼠血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)濃度進行測定，其結(jié)果見表5。

表5 絞股藍籽油對D-半乳糖致衰老小鼠血清生化指標的影響Table 5 Effect of GPSO on biochemical indexes in serum of aging mmol/mL

由表5所知，與空白對照組相比，衰老模型組小鼠血清TC、TG和LDL濃度顯著升高，HDL濃度顯著降低(P<0.05)。與衰老模型組相比，絞股藍籽油低、中、高劑量組小鼠TC濃度極顯著降低(P<0.01)，但灌胃絞股藍籽油各劑量組之間差異不明顯；與衰老模型組相比，灌胃絞股藍籽油中劑量組小鼠的TG濃度極顯著降低(P<0.01)，低、高劑量組小鼠TG濃度也有所降低，且差異達顯著水平(P<0.05)。與衰老模型組相比，絞股藍籽油低、中、高劑量組小鼠LDL濃度顯著降低，HDL濃度顯著上升，但3個劑量組間并無明顯差異。

2.7 絞股藍籽油對D-半乳糖致衰老小鼠肝臟組織生化指標的影響

對D-半乳糖致衰老小鼠肝臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)等指標進行檢測，其結(jié)果見表6。

表6 絞股藍籽油對D-半乳糖致衰老小鼠肝臟組織生化指標的影響Table 6 Effect of GPSO on biochemical indexes in liver of aging

由表6可知，與空白對照組相比，衰老模型組小鼠肝臟組織中的SOD活性和總抗氧化能力(T-AOC)極顯著降低，MDA含量和CAT活性極顯著升高,說明衰老模型組小鼠肝臟總抗氧化能力下降，清除自由基的能力減弱，脂質(zhì)過氧化程度加深，進而導致細胞損傷、機體衰老，說明長期注射D-半乳糖致小鼠衰老造模成功。

表6顯示，與衰老模型組相比，陽性對照組和灌胃絞股藍籽油各劑量組小鼠的SOD活性均有所提高，其中陽性對照組小鼠肝臟SOD水平的提高具有顯著性差異(P<0.05)，低劑量組和中劑量組小鼠SOD水平的提高具有極顯著差異(P<0.01)。說明灌胃絞股藍籽油能在一定程度上增加小鼠肝臟的SOD活性。針對MDA而言，與衰老模型組相比，灌胃絞股藍籽油的各劑量小鼠的MDA含量均呈顯著下降趨勢，說明灌胃絞股藍籽油能降低小鼠肝臟的MDA含量。針對總抗氧化能力(T-AOC)而言，與衰老模型組相比，灌胃絞股藍籽油的各劑量組小鼠的T-AOC活性顯著或極顯著提高，說明灌胃絞股藍籽油可提高小鼠的總抗氧化能力。就CAT而言，與衰老模型組相比，灌胃絞股藍籽油低、中劑量小鼠的CAT活性均極顯著降低，高劑量組和陽性對照組顯著降低，說明灌胃絞股藍籽油可降低小鼠的過氧化程度，但是灌胃絞股藍籽油各劑量組小鼠的抗衰老能力并不會隨著劑量的增加而增大，因此絞股藍籽油對D-半乳糖致衰老小鼠抗衰老能力的提高不構(gòu)成劑量依賴關(guān)系。

2.8 絞股藍籽油對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織生化指標的影響

對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)指標進行測定，其結(jié)果見表7。由表7可知，與空白對照組相比，衰老模型組小鼠腦組織中的SOD活性和總抗氧化能力(T-AOC)降低，MDA含量升高，且均達極顯著差異水平(P<0.01)，說明衰老模型組小鼠腦組織總抗氧化能力下降，清除自由基能力降低，脂質(zhì)過氧化程度加深，亦證實了長期注射D-半乳糖致小鼠衰老造模成功。

表7絞股藍籽油對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織生化指標的影響Table 7 Effect of GPSO on biochemical indexes in cerebrum of aging

與衰老模型組相比，除陽性對照組小鼠T-AOC活性顯著升高外(P<0.05)，其余各組SOD、T-AOC活性和MDA含量均極顯著升高或降低(P<0.01)。說明灌胃絞股藍籽油可降低小鼠腦組織脂質(zhì)過氧化程度，提高總抗氧化能力，提高自由基清除能力，但是不同劑量組氧化能力并不會隨著劑量的增加而增大，因此絞股藍籽油對D-半乳糖致衰老小鼠不構(gòu)成劑量依賴關(guān)系。

以上結(jié)果表明，絞股藍籽油抗衰老機理之一可能與其具有的抗氧化能力有關(guān)，其可以通過增強機體的總抗氧化能力并有效清除自由基，降低機體細胞損傷程度，間接保護正常細胞，從而起到抗衰老的作用。

2.9 絞股藍籽油對D-半乳糖致衰老小鼠肝臟組織病理變化的影響

對空白對照組、衰老模型組及絞股藍籽油低、中、高劑量組小鼠肝臟組織進行病理學鏡檢，結(jié)果如圖1所示。

A.空白對照組；B.衰老模型組；C.陽性對照組；D.絞股藍籽油低劑量組；E.絞股藍籽油中劑量組；F.絞股藍籽油高劑量組A.Control group;B.Aging-model group;C.Positive control group;D.GPSO-L;E.GPSO-M;F.GPSO-H圖1 各組小鼠肝臟組織HE染色病理切片的顯微鏡檢(×40)Fig.1 HE staining of mice liver tissues in experimental groups (×40)

由圖1可知，空白對照組小鼠肝顏色紅潤富有彈性，表面光滑有光澤度，光學顯微鏡檢結(jié)果顯示，肝細胞間連接緊密，核質(zhì)比大，胞漿豐富，以中央靜脈腔為中心呈輻射狀，細胞完整且很規(guī)則，細胞結(jié)構(gòu)與間隙清晰，細胞核圓形位于中央，核質(zhì)分布均勻(圖1-A)；衰老模型組小鼠肝臟明顯腫大，顏色黃白有點狀灰白色，表面粗糙且質(zhì)地稍脆無光澤，光學顯微鏡鏡檢結(jié)果顯示細胞間隙擴大，排列紊亂，壞死細胞較多，細胞輪廓模糊，細胞核多皺縮且胞漿疏松、淡染，出現(xiàn)裂解現(xiàn)象，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂滴空泡，并伴隨胞質(zhì)丟失現(xiàn)象(圖1-B)；陽性對照組小鼠肝細胞排列較紊亂且間隙大，腔靜脈周圍都有少部分壞死細胞，細胞界限模糊但病變有所緩解(圖1-C)；絞股藍籽油低劑量組小鼠肝胞排列較整齊而間隙較大，胞質(zhì)內(nèi)有脂滴空泡，胞漿疏松、淡染呈輕度脂肪變性(圖1-D)；絞股藍籽油中劑量組小鼠肝細胞邊緣清晰結(jié)構(gòu)完整，少數(shù)胞質(zhì)內(nèi)有脂滴空泡，病變較小(圖1-E)；絞股藍籽油高劑量組小鼠肝細胞呈輻射狀排列且細胞間隙小，核圓清晰完整，幾乎無壞死細胞，損傷較輕(圖1-F)，說明絞股藍籽油可以有效緩解衰老小鼠的肝損傷情況。

3 討 論

在絞股藍籽油的相關(guān)報道中，劉世彪等[14]對石油醚提取的絞股藍籽油進行了小鼠急性毒性試驗的初步評價，該試驗中選用的最大劑量為一次性經(jīng)口灌胃65 mL/kg，試驗結(jié)果表明，14 d內(nèi)小鼠活動正常，體質(zhì)量增加均衡，無明顯中毒癥狀，亦無死亡現(xiàn)象發(fā)生；同時對小鼠進行解剖鏡檢，各主要臟器也未發(fā)現(xiàn)可見的異常變化，故按照保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范的急性毒性分級標準，初步認定絞股藍籽油為無毒級，且富含多不飽和脂肪酸[2]，可作為營養(yǎng)保健植物食用油使用。本試驗采用超臨界CO2萃取絞股藍籽油，避免了溶劑殘留的影響，并通過急性經(jīng)口毒性試驗及2項遺傳毒性試驗結(jié)合的方法，進一步驗證了絞股藍籽油的食用安全性。但考慮到絞股藍籽油含有大量α-桐酸，且油脂的脂肪酸組成結(jié)構(gòu)與桐油極為相似，α-桐酸的含量也幾乎相當，而誤食桐油發(fā)生中毒的事件時有報道[15-17]，普遍的觀點認為桐油的毒性來源于α-桐酸，因此，僅通過急性經(jīng)口毒性試驗及遺傳毒性試驗檢測評價絞股藍籽油的食用安全性，尚是遠遠不夠的，還需要經(jīng)過慢性毒性試驗等大量檢測進行進一步考察。此外，也有文獻報道，同樣含有大量α-桐酸的苦瓜籽油和栝樓籽油均可作為食用油脂用于日常飲食，平均壽命最長的日本人也有長期食用苦瓜的習慣[18-20]，這些事例似乎又證明，這些含有大量α-桐酸的植物油甚至α-桐酸本身可能都是無毒的。推測桐油的毒性來源一方面是桐油籽中含有的有毒皂素等物質(zhì)，一方面是以α-桐酸為主構(gòu)成的甘油三酯因組成或結(jié)構(gòu)不同而產(chǎn)生有毒或無毒的植物油脂[21-22]。此外，桐油的急性中毒也可能與攝入量密切相關(guān)，而α-桐酸具有的抗癌、減肥、降血脂等有益的生理功效，也不會因為桐油的毒性而被掩蓋[23]。因此，在充分驗證絞股藍籽油無毒的基礎(chǔ)上，有望將其開發(fā)成富含α-桐酸的可食用天然植物油，以取代桐油成為更加安全的α-桐酸的天然來源。

本試驗以絞股藍籽油為對象，采用皮下注射D-半乳糖的方法構(gòu)建小鼠衰老模型，初步研究其抗衰老作用。隨著灌胃和注射時間的延長，小鼠出現(xiàn)飲食量下降，皮毛光澤度變差，行動緩慢，體質(zhì)量增加緩慢甚至下降的癥狀，說明長期注射D-半乳糖會導致小鼠食欲及吸食能力不斷下降，而絞股藍籽油可以緩解這一癥狀。肝臟指數(shù)分析表明，絞股藍籽油對小鼠肝臟可以起到保護作用。脾臟和胸腺指數(shù)是評價機體免疫功能的主要生化指標，灌胃絞股藍籽油各劑量組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均較衰老模型線小鼠有所提高，說明絞股藍籽油可通過提高小鼠脾臟和胸腺的生理機能從而達到增強小鼠免疫功能的目的。本研究顯示，供試小鼠的腎臟指數(shù)未出現(xiàn)異常，說明絞股藍籽油對小鼠腎臟功能影響不大。血清生化指標測定結(jié)果表明，長期食用絞股藍籽油不會增加血清中的TC和TG濃度，反而可明顯降低衰老小鼠血清的LDL濃度，增加HDL濃度，說明絞股藍籽油可能通過調(diào)節(jié)血清血脂TC、TG、LDL、HDL濃度，改善血脂代謝進而起到抗衰老作用[24]。肝臟組織和腦組織生化指標的測定結(jié)果說明，絞股藍籽油在一定程度上能顯著輔助和增強SOD活性，降低MDA含量，提高總抗氧化能力，表明絞股藍籽油抗衰老機理之一可能與其抗氧化能力有關(guān)，其可能通過增強機體的總抗氧化能力并有效清除自由基，降低機體細胞損傷程度，間接保護正常細胞，從而起到抗衰老作用[25-26]。小鼠肝臟組織石蠟切片顯示，灌胃不同劑量絞股藍籽油均可有效緩解衰老小鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)過氧化和自由基攻擊等造成的氧化損傷，降低肝細胞腫脹甚至壞死的程度，調(diào)節(jié)細胞恢復生理功能和正常代謝，表明絞股藍籽油有一定的抗衰老活性。

4 結(jié) 論

絞股藍籽油食品安全性毒理學評價初步認定，絞股藍籽油屬實際無毒物質(zhì)，小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗和精子畸形試驗也表明，絞股藍籽油不會對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核數(shù)造成顯著影響，對小鼠精子無致畸變作用。另外，絞股藍籽油有一定的抗衰老作用，且其抗衰老機理可能與其所具有的抗氧化能力有關(guān)。

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