牛小豆 李子健 張永珍

100191 北京大學(xué)第三醫(yī)院心內(nèi)科，血管醫(yī)學(xué)研究所，衛(wèi)生部心血管分子生物學(xué)與調(diào)節(jié)肽重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，分子心血管學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，心血管受體研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，冠心病、高血壓、心肌病和心力衰竭等多種心血管疾病在流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)等方面均存在明顯的性別差異[1]，女性心血管疾病的臨床表現(xiàn)、病理生理和預(yù)后與男性不同[2]，這種性別的不同可能部分源于心臟功能強(qiáng)弱的差異[3]。但對(duì)單個(gè)心肌細(xì)胞，較少有研究評(píng)價(jià)其功能是否也存在性別差異。

收縮力是心肌細(xì)胞最具代表性的功能，主要反映心肌細(xì)胞發(fā)生縮短的內(nèi)在動(dòng)力，因其能夠?qū)?nèi)外源刺激做出反應(yīng)，可作為預(yù)示健康和疾病心肌的重要指標(biāo)[4-5]。由于單個(gè)心肌細(xì)胞的收縮與整體心臟功能具有良好的相關(guān)性，故對(duì)單個(gè)心肌細(xì)胞施加刺激因素，應(yīng)用電生理、鈣離子成像、細(xì)胞力學(xué)、免疫組織化學(xué)、細(xì)胞生物化學(xué)等方法對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行觀察及定量分析，即可獲取對(duì)心臟功能的深入了解[4，6]。

Ca2+是連接細(xì)胞膜表面動(dòng)作電位與心肌細(xì)胞收縮的重要介質(zhì)，在興奮-耦聯(lián)過程中起關(guān)鍵作用，其濃度變化調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞收縮和舒張[7]。在心肌細(xì)胞的一個(gè)收縮周期中，去極化刺激引起細(xì)胞膜L型鈣通道開放，少量Ca2+由胞外進(jìn)入心肌細(xì)胞內(nèi)，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放大量的Ca2+，進(jìn)而引起心肌收縮，這種由心肌細(xì)胞膜去極化誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度瞬時(shí)性增高，稱為鈣瞬變。檢測(cè)鈣瞬變的變化有助于深入了解心肌細(xì)胞電活動(dòng)狀態(tài)。

在本研究中，我們采用主動(dòng)脈逆行灌流和膠原酶Ⅱ消化的方法分離成年小鼠心肌細(xì)胞，旨在測(cè)定并比較不同性別成年小鼠心肌細(xì)胞收縮力和鈣瞬變，評(píng)價(jià)性別對(duì)成年小鼠心肌細(xì)胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

8～12周齡C57BL/6小鼠來源于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2016-0041；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0010]，體重24～27g，飼養(yǎng)溫度(25±2)℃，12 h/12 h明暗交替，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理要求。

2，3-丁二酮一肟(BDM)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；Ⅱ型膠原酶及Fura-2，AM購(gòu)自Invitrogen公司；細(xì)胞收縮及離子濃度同步測(cè)量系統(tǒng)購(gòu)自IonOptix公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌細(xì)胞的分離 小鼠稱重，腹腔內(nèi)注射肝素(250 U/50 g體重)，20 min后腹腔內(nèi)注射0.1%戊巴比妥鈉(5 ml/kg)進(jìn)行麻醉。迅速開胸取心臟，將主動(dòng)脈根部掛于Langendorff 裝置，調(diào)節(jié)灌流液流速至3 ml/min，用含15 mM BDM的臺(tái)式液灌流3 min，換酶液灌流消化25 min，保持灌流液的溫度為37 ℃。待心臟軟化后，剪下心室部分，于酶液中剪碎，鈍口玻璃吸管輕柔吹打，經(jīng)80目細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，除去較大的組織塊，500 r/min離心5 min，棄去上清液。按照液體Ca2+濃度0.6 mM-1.2 mM-1.8 mM順序梯度復(fù)鈣，即：(1)加入B液，輕柔吹勻后，自然沉降10 min，棄去上清；(2)加入B液、C液等體積預(yù)先混勻的液體，輕柔吹勻后，自然沉降10 min，棄去上清；(3)加入C液，輕柔吹勻后，自然沉降10 min。

1.2.2 液體配制 臺(tái)式液：NaCl(137 mM)、KCl(5.4 mM)、HEPES(20 mM)、MgCl2(1.2 mM)、NaH2PO4·2H2O(1.2 mM)、Glucose(10 mM)、Taurine(10 mM)，用濃度為2 M的NaOH 調(diào)節(jié)pH值至7.35～7.45，經(jīng)95%O2、5%CO2氧飽和30 min。酶液：18 mgⅡ型膠原酶(260 IU/mg)，15 mg BSA，22.5 mg BDM，用臺(tái)式液定容至15 ml。B液：15 mg BSA，用臺(tái)式液定容至15 ml，加入濃度為1 M的CaCl2母液9 μL，使Ca2+終濃度為 0.6 mM。C液：15 mg BSA，用臺(tái)式液定容至15 ml，加入濃度為1 M的CaCl2母液27 μL，使Ca2+終濃度為1.8 mM。以上所有液體，均經(jīng)0.22 μm孔徑的濾器過濾后使用。

1.2.3 心肌細(xì)胞收縮力和鈣瞬變的檢測(cè) 心肌細(xì)胞負(fù)載熒光染料 Fura-2，AM，負(fù)載濃度為1 μM ，室溫避光孵育20 min。向臺(tái)式液中加入1 M的CaCl2母液使Ca2+終濃度為1.8 mM。棄去上清，加入含1.8 mM Ca2+的臺(tái)式液輕柔吹打洗滌，室溫沉降10 min，棄去上清液，目的是去除殘余染料。取一滴細(xì)胞懸液上機(jī)檢測(cè)，細(xì)胞沉降5 min后，給予10 V、0.5 HZ電場(chǎng)刺激，同時(shí)以含1.8 mM Ca2+的臺(tái)式液灌流，以便及時(shí)補(bǔ)充細(xì)胞收縮及代謝所需能量和電解質(zhì)，并去除代謝產(chǎn)物，防止對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。使心肌細(xì)胞穩(wěn)定至少2 min后，記錄心肌細(xì)胞肌節(jié)長(zhǎng)度變化及鈣瞬變幅度變化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用IonWizard 6.2軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)比較

光學(xué)顯微鏡下觀察，桿狀細(xì)胞約70%～80%，細(xì)胞邊緣銳利、橫紋清晰、折光性好，且復(fù)鈣后約60～70%的細(xì)胞呈靜息狀態(tài)，無自發(fā)收縮，提示細(xì)胞狀態(tài)良好。用激光共聚焦顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)，比較不同性別成年小鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)外觀無明顯差別 (圖1)。

A：成年雄性C57BL/6小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)；B：成年雌性C57BL/6小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)圖1 不同性別C57BL/6成年小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)比較

2.2 兩組小鼠心肌細(xì)胞收縮力比較

在同樣的電場(chǎng)刺激條件下，檢測(cè)兩組小鼠的心肌細(xì)胞收縮力，發(fā)現(xiàn)成年雄性C57BL/6小鼠心肌細(xì)胞肌節(jié)縮短幅度[(0.14±0.02)μm比(0.08±0.01)μm，t=2.796，P=0.008](圖2)、肌節(jié)縮短率(7.47%±0.93% 比 4.60%±0.59%，t=2.608，P=0.0128)均明顯高于雌性小鼠。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，給予電刺激后，雄性小鼠心肌細(xì)胞最大收縮速度[(-3.25±0.37) μm/s比(-2.11±0.38) μm/s，t=2.163，P=0.0364]及最大舒張速度[(2.45±0.29)μm/s比(1.57±0.31)μm/s，t=2.096，P=0.0421]均高于雌性小鼠心肌細(xì)胞。

A：成年雄性小鼠；B：成年雌性小鼠圖2 不同性別C57BL/6成年小鼠心肌細(xì)胞收縮力比較

2.3 兩組小鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變比較

在相同電場(chǎng)刺激條件下，檢測(cè)不同性別成年C57BL/6小鼠心肌細(xì)胞鈣信號(hào)變化，發(fā)現(xiàn)雄性小鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變的峰值[(0.94±0.06)F340/F380值 比(0.77±0.03)F340/F380值，t=2.843，P=0.010]及鈣瞬變幅度[(0.25±0.04)F340/F380值 比(0.16±0.03)F340/F380值，t=2.218，P=0.040]均明顯高于雌性小鼠(圖3)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，雄性小鼠舒張期鈣離子消除時(shí)間常數(shù)明顯小于雌性小鼠[(122.40±22.99)ms比(189.20±19.54)ms，t=2.112，P=0.049]，提示雄性成年小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回?cái)zCa2+的速率大于雌性成年小鼠心肌細(xì)胞。

A：成年雄性小鼠；B：成年雌性小鼠圖3 兩組小鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變比較

3 討論

性別影響心臟損傷的表現(xiàn)和預(yù)后。在給予短時(shí)程、大劑量異丙腎上腺素引起的心肌損傷模型中，對(duì)于相同的應(yīng)激損傷刺激，雄性小鼠比雌性小鼠更易發(fā)生心肌細(xì)胞破裂和心臟肥厚[8]。在臨床中，絕經(jīng)前女性罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)亦顯著低于同年齡男性，其臨床表現(xiàn)、藥物治療及預(yù)后等也不盡相同[9-10]，因此心臟功能有明顯的性別差異。然而，目前關(guān)于離體單個(gè)細(xì)胞的功能是否存在差異的報(bào)道較少，因此有必要探討細(xì)胞水平的功能是否存在性別差異。本研究比較了不同性別C57BL/6成年小鼠心肌細(xì)胞收縮力和鈣瞬變，發(fā)現(xiàn)成年雄性小鼠心肌細(xì)胞收縮力和鈣瞬變均高于同年齡的成年雌性小鼠心肌細(xì)胞。因此，在基礎(chǔ)研究中，不區(qū)分小鼠性別將會(huì)增大細(xì)胞間的差異，需要選用同一性別的小鼠或者選取匹配只數(shù)和性別的小鼠分離的心肌細(xì)胞。

研究表明，雌激素可通過多種機(jī)制影響心肌細(xì)胞的電-機(jī)械活動(dòng)。Kravtsov等[11]研究表明，與對(duì)照組相比，卵巢切除術(shù)后成年大鼠的心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)蘭尼丁受體及鈉-鈣交換通道活性增加，收縮和舒張能力均增強(qiáng)，而給予雌激素則能夠逆轉(zhuǎn)這種改變，表明雌激素能夠抑制心肌細(xì)胞收縮力，這與本研究結(jié)果一致。關(guān)于其機(jī)制，既往研究顯示，雌激素可以下調(diào)β1腎上腺素受體(β1AR)的表達(dá)并抑制細(xì)胞蛋白激酶A的活性，進(jìn)而抑制下游鈣通道的激活，減少Ca2+內(nèi)流，最終抑制心臟功能[11-12]；此外，心肌細(xì)胞收縮力還受肌絲蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾、肌絲蛋白對(duì)Ca2+的敏感性等多種因素影響[12]。因此，成年雄鼠心肌細(xì)胞收縮力高于雌鼠的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。此外，Ca2+是心肌細(xì)胞最重要的第二信使，在調(diào)節(jié)心肌收縮、電信號(hào)傳導(dǎo)及心臟節(jié)律中具有重要作用[13]。Fares等[14]研究證實(shí)，卵巢切除術(shù)后成年C57BL/6小鼠的心肌細(xì)胞Ca2+釋放幅度較假手術(shù)組明顯增加；同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)雌激素能夠抑制心肌細(xì)胞肌絲對(duì)Ca2+的敏感性，表明雌激素能夠負(fù)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平[15]，這與本研究中成年雌鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變低于雄鼠的發(fā)現(xiàn)類似。Ca2+調(diào)節(jié)蛋白或離子通道，如受磷蛋白、鈣離子-鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、NCX、Ryr、肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶等均能對(duì)鈣瞬變的幅度或者時(shí)程進(jìn)行調(diào)控，因此需要進(jìn)一步探索Ca2+相關(guān)調(diào)控蛋白及離子通道是否參與調(diào)控。

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)成年雄性C57BL/6小鼠心肌細(xì)胞收縮力和鈣瞬變高于雌性小鼠。因此，研究中應(yīng)考慮到性別對(duì)成年小鼠心肌細(xì)胞功能的影響。

利益沖突：無

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Regitz-Zagrosek V，Kararigas G.Mechanistic Pathways of Sex Differences in Cardiovascular Disease[J].Physiol Rev，2017，97(1)：1-37.DOI：10.1152/physrev.00021.2015.

[2] Rosano GM，Spoletini I，Vitale C.Cardiovascular disease in women，is it different to men? The role of sex hormones[J].Climacteric，2017，20(2)：125-128.DOI：10.1080/13697137.2017.1291780.

[3] Feridooni HA，Macdonald JK，Ghimire A，et al.Acute exposure to progesterone attenuates cardiac contraction by modifying myofilament calcium sensitivity in the female mouse heart[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2017，312(1)：46-59.DOI：10.1152/ajpheart.00073.2016.

[4] Bazan C，Barba DT，Hawkins T，et al.Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes[J].Biophys Rev，2012，4(3)：231-243.DOI：10.1007/s12551-012-0082-y.

[5] Gaitas A，Malhotra R，Li T，et al.A device for rapid and quantitative measurement of cardiac myocyte contractility[J].Rev Sci Instrum，2015，86(3)：034302.DOI：10.1063/1.4915500.

[6] Louch WE，Sheehan KA，Wolska BM.Methods in cardiomyocyte isolation，culture，and gene transfer[J].J Mol Cell Cardiol，2011，51(3)：288-298.DOI：10.1016/j.yjmcc.2011.06.012.

[7] Eisner DA，Caldwell JL，Kistamas K，et al.Calcium and Excitation-Contraction Coupling in the Heart[J].Circ Res，2017，121(2)：181-195.DOI：10.1161/CIRCRESAHA.117.310230.

[8] 喬鈺惠，朱寶玲，李子健，等.性別對(duì)小鼠急性心肌損傷后心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響[J].中國(guó)心血管雜志，2017，22(2)：134-139.DOI：10.3969/j.issn.1007-5410.2017.02.013.

Qiao YH，Zhu BL，Li ZJ，et al.Effects of gender on cardiac structure and function after acute myocardial injury in mice[J].Chin J Cardiovasc Med，2017，22(2)：134-139.DOI：10.3969/j.issn.1007-5410.2017.02.013.

[9] 王建南，何青.老年女性高血壓[J].中國(guó)心血管雜志，2017，22(6)：447-451.DOI：10.3969/j.issn.1007-5410.2017.06.015.

Wang JN，He Q.Hypertension in aged female[J].Chin J Cardiovasc Med，2017，22(6)：447-451.DOI：10.3969/j.issn.1007-5410.2017.06.015.

[10] 王佳玉，王德昭，陳威，等.女性急性ST段抬高型心肌梗死患者的臨床特點(diǎn)[J].中國(guó)心血管雜志，2017，22(5)：332-336.DOI：10.3969/j.issn.1007-5410.2017.05.005.

Wang JY，Wang DZ，Chen W，et al.Clinical characteristics of acute ST elevation myocardial infarction in women [J].Chin J Cardiovasc Med，2017，22(5)：332-336.DOI：10.3969/j.issn.1007-5410.2017.05.005.

[11] Kravtsov GM，Kam KW，Liu J，et al.Altered Ca2+handling by ryanodine receptor and Na+-Ca2+exchange in the heart from ovariectomized rats：role of protein kinase A[J].Am J Physiol Cell Physiol，2007，292(5)：1625-1635.DOI：10.1152/ajpcell.00368.2006.

[12] Kam KW，Kravtsov GM，Liu J，et al.Increased PKA activity and its influence on isoprenaline-stimulated L-type Ca2+channels in the heart from ovariectomized rats[J].Br J Pharmacol，2005，144(7)：972-981.DOI：10.1038/sj.bjp.0706123.

[13] Marks AR.Cardiac intracellular calcium release channels：role in heart failure[J].Circ Res，2000，87(1)：8-11.DOI：10.1161/01.RES.87.1.8.

[14] Fares E，Parks RJ，Macdonald JK，et al.Ovariectomy enhances SR Ca2+release and increases Ca2+spark amplitudes in isolated ventricular myocytes[J].J Mol Cell Cardiol，2012，52(1)：32-42.DOI：10.1016/j.yjmcc.2011.09.002.

[15] Wattanapermpool J，Riabroy T，Preawnim S.Estrogen supplement prevents the calcium hypersensitivity of cardiac myofilaments in ovariectomized rats[J].Life Sci，2000，66(6)：533-543.