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        基于OAV和AEDA對工夫紅茶的PLSR分析

        2018-05-23 01:27:38肖作兵王紅玲牛云蔚朱建才
        食品科學 2018年10期
        關鍵詞:芳樟醇工夫紅茶

        肖作兵,王紅玲,牛云蔚,*,朱建才,馬 寧

        (1.上海應用技術大學香料香精技術與工程學院,上海 201418;2.上海香料研究所,上海 200232)

        茶葉是世界上受歡迎的第二大無酒精飲料[1]。紅茶屬于全發(fā)酵茶,是以芽葉為原料,經萎凋、揉捻(切)、發(fā)酵、干燥等工藝精制而成[2-3]。紅茶又可分為工夫紅茶、紅碎茶和小種紅茶[4]。其中,工夫紅茶是我國特有的傳統(tǒng)產品,可按地區(qū)命名為閩紅工夫(包括坦洋工夫、白琳工夫、政和工夫)、江蘇工夫及粵紅工夫、越紅工夫、滇紅工夫、祁門工夫和寧紅工夫等[5]。

        茶葉的外形、湯色、香氣、滋味和葉底是茶葉的品質指標,香氣是一種評價茶葉好壞的重要因素[6-7]。因此,研究工夫紅茶的香氣對于工夫紅茶品質的研究具有重要意義。目前,研究茶葉的香氣成分主要以氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)和氣相色譜-嗅聞(gas chromatography-olfactometry,GC-O)為主,如劉春麗等[8]通過同時蒸餾提取對武夷山新紅茶(金駿眉、銀駿眉、妃子笑、金針梅)的香氣成分進行了分析。Lü Haipeng等[9]采用頂空固相微萃取(headspace-solid phase microextraction,HS-SPME)法結合GC-MS和GC-O對普洱茶中的揮發(fā)性成分進行了分析。Baba等[10]采用溶劑輔助風味蒸發(fā)法結合GC-MS和GC-O技術對3 種綠茶(龍井、毛峰、碧螺春)中的揮發(fā)性成分進行了分析。有學者采用GC-MS結合化學計量學對茶葉的香氣成分進行了研究,如姚逸[11]對10 個川紅和10 個滇紅進行GC-MS分析,并結合主成分分析(principal component analysis,PCA)建立了2 種紅茶的香氣質量評價模型。Lü Shidong等[12]以HS-SPME為提取方法,采用GC-MS結合聚類分析和PCA來區(qū)別普洱茶和茯磚茶。此外,還有學者采用感官分析結合化學計量學對香氣成分進行研究,如Kraujalyt?等[13]對不同加工方法(凍干、噴霧、脫咖啡因)的速溶茶進行感官評價,并結合含量進行了分析。Niu Yunwei等[14]對感官屬性與活性香氣成分進行了偏最小二乘回歸(partial least squares regression,PLSR)法相關性研究。目前,對中國傳統(tǒng)工夫紅茶香氣成分的研究還較少,且還未有結合香氣活力值(odor activity values,OAV)和Log4FD值確定關鍵香氣成分,并結合PLSR來分析中國工夫紅茶中的關鍵香氣成分與感官屬性的相關性。

        本研究對4 種不同來源的工夫紅茶,采用頂空蒸汽蒸餾提?。╤eadspace steam distillation extraction,HSDE)結合氮吹濃縮法[15],并結合GC-MS分析技術研究不同工夫紅茶的揮發(fā)性成分的差異,并結合OAV和Log4FD值對工夫紅茶的香氣成分進行分析,以期明確工夫紅茶中的關鍵香氣物質與感官屬性之間的關系,為探究我國傳統(tǒng)工夫紅茶的香氣提供理論依據,同時也為紅茶飲品的改善與提高作出貢獻。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        坦洋工夫紅茶(特級) 福建新坦洋茶業(yè)(集團)股份有限公司;宜昌工夫紅茶(特級) 湖北省宜都市宜紅茶業(yè)有限公司;滇紅工夫紅茶(特級) 云南滇紅集團股份有限公司;祁門工夫紅茶(特級) 安徽省祁門紅茶發(fā)展有限公司。茶葉樣品密封保存于4 ℃冰箱中待用。

        二氯甲烷、無水硫酸鈉(均為分析純) 上海泰坦化學有限公司;C7~C30正構烷烴(色譜純) 美國Sigma-Aldrich公司;氘代愈創(chuàng)木酚(色譜純) 加拿大C/D/N ISOTopes公司。

        1.2 儀器與設備

        7890A/5975C GC-MS聯(lián)用儀、7890(FID)-ODP GC-O裝置 美國Agilent公司;HSDE裝置 上海有機化學研究所定制;PBC-B2氮吹儀 上海皓莊儀器有限公司;HH-6電子恒溫不銹鋼水浴鍋 上??瞥綄嶒炘O備有限公司;DRT-TW電加熱套 鄭州長城科工貿有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 HSDE提取工夫紅茶揮發(fā)性成分

        1.3.2 溶劑萃取工夫紅茶揮發(fā)性成分

        將80.00 μL 230.00 mg/L的氘代愈創(chuàng)木酚溶液作為內標物加入收集瓶中與收集到的茶湯混勻,隨后依次用20.00、20.00、10.00 mL的二氯甲烷溶劑萃取3 次,將溶劑萃取得到的萃取液加入少量無水硫酸鈉以除去剩余的水分,于4 ℃冰箱中靜置過夜后用氮吹儀將萃取液濃縮至0.20 mL,樣品冷藏于-20 ℃的冰箱中待GC-MS分析。

        1.3.3 GC-MS條件

        GC條件:Agilent J&W HP-INNOWAX石英毛細管柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:40 ℃保持6 min,以3 ℃/min升至100 ℃,不保持,再以5 ℃/min升至230 ℃,保持10 min;載氣(He)流速1.0 mL/min;進樣量1.00 μL;不分流進樣;進樣口溫度250 ℃。

        MS條件:電子電離源;電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;傳輸線溫度280 ℃;四極桿溫度150 ℃;采集方式為全掃描,質量掃描范圍m/z 30~450;掃描速率1 scan/s。

        將分析所得質譜結合人工解譜與Wiley7n、NIST 11標準譜庫的檢索結果進行比對,同時計算各物質的保留指數(shù)(retention index,RI),并與文獻中的RI(RI可查閱http://www.odour.org.uk/lriindex.html;http://www.flavornet.org/flavornet.html),以及購買的標準品對比進行定性[16]。

        1.3.4 GC-O測定條件及芳香萃取物稀釋分析(aroma extract dilution analysis ,AEDA)方法

        7) 主機調速。當主機運行時,根據主車鐘令和速度調節(jié)曲線計算出給定轉速,系統(tǒng)向電噴控制系統(tǒng)發(fā)出轉速設定指令,由電噴控制系統(tǒng)控制主機調速。

        色譜條件及程序升溫條件同GC-MS。由4 位(2 男2 女)有相關經驗的研究生組成,每個茶樣每位成員嗅聞1 次的同時記錄所聞到的氣味特征、保留時間。當同一保留時間所聞到的氣味特征相同(至少有2 位成員相同),則將其記錄為有效結果。將得到的濃縮液用溶劑(二氯甲烷)梯度稀釋(1∶41、1∶42、1∶43……),直至成員在嗅聞口聞不到任何氣味停止稀釋,并記錄最高稀釋倍數(shù)作為稀釋因子(flavor dilution,F(xiàn)D),其中Log4FD值不小于4的揮發(fā)性物質定義為工夫紅茶中的香氣成分。

        根據記錄有效的保留時間來計算各物質的RI,與購買的標準品及文獻中的RI對比進行,同時根據記錄的香氣描述來進行定性。

        1.3.5 定量與OAV的計算

        定量分析:以氘代愈創(chuàng)木酚為內標,采用內標法來定量。

        式中:Ci為揮發(fā)性成分的含量/(ng/kg);OTi為揮發(fā)性成分在參考文獻中的香氣閾值/(ng/kg)。其中,OAV不小于1的揮發(fā)性物質定義為工夫紅茶中的香氣成分。

        1.3.6 感官評價方法

        紅茶的泡制方法參照GB/T 23776—2009《茶葉感官審評方法》進行,感官屬性的確定參照GB/T 14487—2008《茶葉感官審評術語》和參考文獻[19]并稍微改動,最終確定為:果香、花香、麥芽香、青草香、甜香、木香。采用九點法來進行評分(1-非常輕、5-中等強度、9-非常強),感官評價小組由8 名(4 男4 女,年齡在22~30 歲)進行過相關香氣屬性訓練的成員組成,每個成員在不知編碼的情況下重復3 次進行。

        1.4 數(shù)據統(tǒng)計分析

        應用SPSS v19.0統(tǒng)計分析軟件對定量數(shù)據和感官數(shù)據進行單因素方差分析。應用Unscrambler v 9.7軟件對4 種工夫紅茶的關鍵香氣成分及感官數(shù)據進行PLSR相關性分析。PLSR法是一種多因變量對多自變量的回歸建模方法,其能夠通過對系統(tǒng)中數(shù)據信息的分解和篩選,從而克服自變量之間多重相關性及樣本點數(shù)據少等問題在系統(tǒng)建模中產生的不良影響[20-21]。

        2 結果與分析

        2.1 4 種工夫紅茶的揮發(fā)性成分及含量分析

        由表1可知,共檢測到88 種揮發(fā)性物質,其中包括醇類24 種、醛類19 種、酯類和內酯類10 種、酮類17 種、吡嗪類7 種、酸類3 種及其他類8 種,每類揮發(fā)性成分的比較結果如圖1所示。通過比較發(fā)現(xiàn),4 種工夫紅茶醇類物質含量最高,其次是醛類、酯和內酯類。祁門工夫紅茶中含有的醇類和醛類物質最多,而宜昌工夫紅茶含有的酯和內酯類、酮類和酸類物質最多,尤其是酸類成分。

        坦洋工夫紅茶中共檢測出76 種香氣成分,含量較高(>1 000.00 ng/kg)的成分有:苯乙醇(3 199.47 ng/kg)、香葉醇(2 478.09 ng/kg)、苯甲醇(2 267.47 ng/kg)、苯乙醛(1 857.25 ng/kg)、2-乙酰基吡咯(1 496.36 ng/kg)和糠醇(1 187.14 ng/kg)。

        宜昌工夫紅茶中共檢測出76 種香氣成分,含量較高(>1 000.00 ng/kg)的成分有:苯乙醇(4 547.07 ng/kg)、苯乙醛(2 058.16 ng/kg)、苯甲醇(1 812.03 ng/kg)、反-2-己烯酸(1 758.73 ng/kg)、香葉醇(1 655.66 ng/kg)、二氫彌猴桃內酯(1 388.82 ng/kg)和2-乙?;量? 187.74 ng/kg)。

        祁門工夫紅茶中共檢測出77 種香氣成分,含量較高(>1 000.00 ng/kg)的成分有:芳樟醇(3 146.70 ng/kg)、苯乙醛(2 298.71 ng/kg)、反式氧化芳樟醇(2 270.42 ng/kg)、2,4-二甲基苯甲醛(2 140.58 ng/kg)、香葉醇(2 045.75 ng/kg)、苯乙醇(1 735.46 ng/kg)、水楊酸甲酯(1 677.68 ng/kg)、苯甲醇(1 622.10 ng/kg)和反-2-己烯醛(1 053.15 ng/kg)。

        滇紅工夫紅茶中共檢測出75 種香氣成分,含量較高(>1 000.00 ng/kg)的成分有:香葉醇(3 024.64 ng/kg)、苯乙醇(2 945.56 ng/kg)、苯乙醛(2 701.65 ng/kg)、苯甲醇(2 624.89 ng/kg)和反式氧化芳樟醇(1 646.93 ng/kg)。

        由表1可知,具有花香和蜜香的苯乙醇,具有花香和甜香的苯甲醇,具有花香的香葉醇,具有甜香和蜜香的苯乙醛在4 種工夫紅茶中均有較高含量,這與紅茶以花香和蜜甜香為主調的香氣相符[22]。此外,芳樟醇及其氧化物的含量也比較高(OAV>1),這也與之前的研究結果相符是主要的香氣物質[23-26]。

        由圖1和表1可知,4 種工夫紅茶的揮發(fā)性成分盡管在種類和含量上存在一定的差異,但其主要成分是相似的,4 種工夫紅茶的共有揮發(fā)性成分54 種,包括醇類16 種、醛類10 種、酯類和內酯類7 種、酮類11 種、吡嗪類4 種及其他類6 種。此外,由表1可知,Duncan多重分析結果表明,共有成分中以下成分具有顯著性差異:葉醇、反式氧化芳樟醇、香葉醇、苯乙醇、壬醛、十六酸甲酯、二氫彌猴桃內酯、2-庚酮、(反,反)-3,5-辛二烯-2-酮、β-突厥烯酮、β-紫羅蘭酮、順式茉莉酮、吡嗪、2-乙基吡嗪、2-乙酰呋喃和2-乙?;量?。共有成分中無顯著性差異的為反-2-辛烯醛。

        圖1 不同工夫紅茶揮發(fā)性成分分類比例的比較Fig. 1 Comparisons of the total contents of all classes of volatile components in different congou black teas

        表1 工夫紅茶中揮發(fā)性成分的含量和OAVTable 1 Contents and OAV of volatile components in different congou black teas

        續(xù)表1

        續(xù)表1

        2.2 主要香氣組分的OAV分析

        OAV用于評價揮發(fā)性物質對茶葉香氣的貢獻,通常認為OAV大于1的物質對茶葉的香氣有貢獻[24]。由表1可知,共有30 種揮發(fā)性成分的OAV大于1,以醇類、醛類和酯類為主。其中,醇類主要賦予紅茶以花香、果香和甜香香氣,醛類主要賦予紅茶以青香和草香香氣,酯類主要賦予紅茶以青香、花香和果香,酮類主要賦予紅茶以香氣。這些主要關鍵香氣成分的相互協(xié)調與融合,賦予工夫紅茶的特征香型。在4 種茶中OAV均大于1的共性香氣成分有順-6-壬烯醇、香葉醇、苯乙醇、反-2-己烯醛、水楊酸甲酯、γ-壬內酯和香豆素。其中,OAV最高的是順-6-壬烯醇(>40)和香葉醇(>20),這2 種香氣成分對工夫紅茶的香氣貢獻最大,賦予紅茶以花香和甜香香氣,其次是水楊酸甲酯(>10),主要賦予紅茶以花香和草香。

        2.3 主要香氣組分的AEDA結果

        通過HSDE法結合GC-O分析,表2結果表明4 種工夫紅茶中共分離出55 種香氣物質(Log4FD≥1),包括醇類(20 種)、醛類(10 種)、酯類和內酯類(7 種)、酮類(9 種)和其他(4 種),其中有33 種揮發(fā)性物質的Log4FD值不小于4被確定為活性香氣物質,此外,有36 種揮發(fā)性物質在4 種工夫紅茶中均被嗅聞到。從香氣描述可知工夫紅茶的香氣特征為:青、甜、花、果香等,其中花香、甜香和果香尤為重要。從GC-O的分析結果Log4FD值可以發(fā)現(xiàn):4 種工夫紅茶中的葉醇、庚醇、反式氧化芳樟醇、香葉醇、苯乙醇、橙花叔醇、反-2-己烯醛、苯乙醛、水楊酸甲酯、2,3-丁二酮的Log4FD值均比較高(Log4FD≥4),此外,4 種工夫紅茶中除祁門工夫紅茶沒有嗅聞到外,其他3 種工夫紅茶中的順-6-壬烯醇的Log4FD值不小于5。而吡嗪類物質在祁門工夫紅茶和滇紅工夫紅茶中的Log4FD值均比較低,吡嗪類物質主要以烤香、可可香、咖啡、堅果香為主。

        表2 AEDA法確定不同工夫紅茶中的活性香氣物質Table 2 Aroma-active compounds of different congou black teas characterized by aroma extract dilution analysis

        續(xù)表2

        由以上結果對比OAV和Log4FD值可知,兩者在結果上存在一定的相似性,葉醇、反式氧化芳樟醇、香葉醇、苯乙醇、橙花叔醇、反-2-己烯醛、苯乙醛、水楊酸甲酯和2,3-丁二酮的OAV和Log4FD值均比較高,說明它們是工夫紅茶的重要香氣成分,且反式氧化芳樟醇呈花香氣息,香葉醇主要具有溫和、甜的玫瑰花氣息,苯乙醇具有柔和、愉快而持久的玫瑰香,橙花叔醇呈玫瑰及蘋果香氣,反-2-己烯醛呈濃郁新鮮水果香氣,2,3-丁二酮呈花果香氣息,這些均構成了工夫紅茶的花香、果香、甜香氣息。此外,2 種方法也存在差異性,如庚醇有較高的Log4FD值,但其OAV卻不高,這可能是因為化合物之間的相互協(xié)同作用而使得其被嗅聞到,順-6-壬烯醇在祁門工夫紅茶中未檢出,而其OAV大于40,這可能與所采用的水中的閾值并不能真正反映該物質的閾值有關[21]。2 種方法結合最終確定了22 種關鍵香氣物質為:1-戊醇、葉醇、1-辛烯-3-醇、反式氧化芳樟醇、芳樟醇、順-6-壬烯醇、香葉醇、苯甲醇、苯乙醇、橙花叔醇、戊醛、己醛、反-2-己烯醛、糠醛、(反,反)-2,4-庚二烯醛、苯乙醛、(反,反)-2,4-癸二烯醛、水楊酸甲酯、丙位-壬內酯、2,3-丁二酮、2-庚酮和香豆素。

        2.4 工夫紅茶的感官屬性與關鍵香氣成分的相關性分析

        表3 4 種工夫紅茶感官分析結果Table 3 Sensory evaluation of four Chinese congou black teas

        如表3、圖2所示,工夫紅茶中的關鍵香氣物質與感官屬性的加權回歸系數(shù)(weighted regression coefficient,BW)的絕對值小于0.16(而|BW|的大小與相關性呈正比),選取|BW|不小于0.09的關鍵香氣物質為顯著性相關物質,果香與芳樟醇(A14)、己醛(B2)、反-2-己烯醛(B5)、(反,反)-2,4-癸二烯醛(B18)和水楊酸甲酯(C4)呈顯著負相關,與苯乙醇(A22)呈顯著正相關?;ㄏ闩c1-戊醇(A2)、苯甲醇(A21)、戊醛(B1)、苯乙醛(B15)和香豆素(G8)呈顯著負相關,與順式-6-壬烯醇(A17)、橙花叔醇(A23)、糠醛(B9)、水楊酸甲酯(C4)和2,3-丁二酮(D1)呈顯著正相關。麥芽香與1-戊醇(A2)、1-辛烯-3-醇(A9)、戊醛(B1)、丙位-壬內酯(C7)和2-庚酮(D6)呈顯著正相關,與2,3-丁二酮(D1)呈顯著負相關。青草香與1-戊醇(A2)、苯乙醇(A22)和2-庚酮(D6)呈顯著負相關,與己醛(B2)、反-2-己烯醛(B5)和2,3-丁二酮(D1)呈顯著正相關。甜香與葉醇(A6)和糠醛(B9)呈顯著負相關,反式氧化芳樟醇(A12)、芳樟醇(A14)和(反,反)-2,4-癸二烯醛(B18)呈顯著正相關。木香與反式氧化芳樟醇(A12)、苯乙醛(B15)和(反,反)-2,4-癸二烯醛(B18)呈顯著正相關,與順-6-壬烯醇(A17)和糠醛(B9)呈顯著負相關。

        圖2 工夫紅茶中關鍵香氣成分與感官屬性的PLS1模型分析Fig. 2 Standardized and estimated regression coefficients from PLS1 prediction models for the sensory attributes variables

        3 結 論

        通過HSDE-GC-MS技術分析共檢測出88 種揮發(fā)性成分,比較發(fā)現(xiàn)4 種工夫紅茶的揮發(fā)性成分盡管在種類和含量上存在一定的差異,但其主要成分是相似的。通過對OAV和AEDA的分析,確定了對工夫紅茶香氣起重要作用的22 種關鍵香氣物質為:1-戊醇、葉醇、1-辛烯-3-醇、反式氧化芳樟醇、芳樟醇、順-6-壬烯醇、香葉醇、苯甲醇、苯乙醇、橙花叔醇、戊醛、己醛、反-2-己烯醛、糠醛、(反,反)-2,4-庚二烯醛、苯乙醛、(反,反)-2,4-癸二烯醛、水楊酸甲酯、丙位-壬內酯、2,3-丁二酮、2-庚酮和香豆素。

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