劉 靜，周景樂，陳振江，魏學(xué)凱，李 濤，李春杰

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

多年生黑麥草(Loliumperenne)為禾本科黑麥草屬植物，分蘗能力強，成坪速度快，適應(yīng)土壤范圍廣，耐寒耐踐踏，常作為建植草地的先鋒草種[1]。作為草坪草，黑麥草已被廣泛種植，但其喜溫暖濕潤的環(huán)境，抗旱性差[2]，因此，對多年生黑麥草抗旱性的研究具有重要意義。

內(nèi)生真菌是指在其生活史的部分或全部階段生活于植物組織內(nèi)，對植物沒有引起明顯病害癥狀的真菌[3]。研究表明，禾草-內(nèi)生真菌共生體穩(wěn)定的互利共生關(guān)系不僅保證了內(nèi)生真菌所需的全部營養(yǎng)物質(zhì)，而且共生體產(chǎn)生的次生代謝物可顯著提高宿主禾草對病害[4-5]、蟲害[6]等生物脅迫抗性和抗寒[7]、耐鹽[8]等非生物脅迫抗性。目前，國際上對禾草內(nèi)生真菌共生體在干旱脅迫下對種子的萌發(fā)及幼苗生理特性的研究主要集中在高羊茅[9-10](Festucaarundinacea)和多年生黑麥草[11-12](Loliumperenne)等植物上。研究表明內(nèi)生真菌侵染能夠增加高羊茅的根生物量、根系數(shù)量、根長和根直徑，而這些特征能夠增加根部吸收水分的表面積[13]，在多年生黑麥草中也有相同的變化趨勢[14]。但是離體條件下，內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸種對種子的萌發(fā)及幼苗生理特性影響的研究報道較少。鐘松等[15]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的中華羊茅(Festucasinensis)內(nèi)生真菌發(fā)酵液對醉馬草(Achnatheruminebrians)種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、苗長、根長、苗鮮質(zhì)量等指標(biāo)起到不同程度的抑制或促進(jìn)作用。王維[16]發(fā)現(xiàn),PI-Z02發(fā)酵液對蘿卜(Raphanussativus)和油菜(Brassicanapus)的發(fā)芽有明顯的促生作用。

干旱是影響植物生長的主要非生物脅迫因素之一[17]。種子在發(fā)芽階段的耐旱狀況，在一定程度上反應(yīng)了該種子的耐旱程度[18]。在西北地區(qū)，水分不足很大程度上影響了草坪草的種植和推廣。因此，對黑麥草種子萌發(fā)進(jìn)行抗旱性研究具有極其重要的意義。PEG模擬干旱脅迫對種子抗旱性進(jìn)行研究是目前研究的熱點,其具有操作簡單，可重復(fù)性強等優(yōu)點[19]。雖然我國對禾草內(nèi)生真菌研究起步比較晚，但關(guān)于禾草內(nèi)生真菌共生體抗旱性的研究已經(jīng)有了大量的報到，陳志豪等[20]發(fā)現(xiàn)高羊茅種子萌發(fā)時，用PEG-6000模擬干旱脅迫種子，感染內(nèi)生真菌的高羊茅種子發(fā)芽率和胚根長均高于非感染種子，說明內(nèi)生真菌浸染能夠提高高羊茅種子萌發(fā)時的耐旱能力。任安芝等[21]就內(nèi)生真菌侵染對黑麥草種子萌發(fā)、幼苗生長及滲透脅迫抗性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在脅迫條件下，被真菌侵染種子的發(fā)芽勢及發(fā)芽率均明顯高于未侵染的種子。李飛[22]研究發(fā)現(xiàn)，在干旱地區(qū)，內(nèi)生真菌侵染促進(jìn)了醉馬草種子的生長；在較重度滲透脅迫條件下，醉馬草E+植株的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、胚芽和胚根長顯著高于E-植株。宋梅玲等[23]在模擬干旱脅迫條件下發(fā)現(xiàn)，-1.2～-0.6 MPa時, E+的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)顯著高于E- (P<0.05)，E+的胚根長、胚芽長和幼苗含水量也顯著大于E-(P<0.05)。但是離體條件下生物脅迫和非生物脅迫的互作對多年生黑麥草種子萌發(fā)的影響研究較少。

本研究以不帶內(nèi)生真菌的黑麥草為研究對象，用醉馬草、披堿草(Elymusdahuricus)、中華羊茅3種禾草內(nèi)生真菌發(fā)酵液對黑麥草種子進(jìn)行浸種，旨在探索不同濃度PEG脅迫下內(nèi)生真菌在離體狀態(tài)下對多年生黑麥草種子萌發(fā)的影響，為內(nèi)生真菌在離體狀態(tài)下對植物抗逆性的影響提供理論依據(jù)。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

種子：多年生黑麥草品種為頂峰(Pinnacle)，由蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院提供[24]。采收種子5 ℃下保存于農(nóng)業(yè)部牧草與草坪草種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(蘭州)貯藏室，備用。

菌株：分離于醉馬草的甘肅內(nèi)生真菌(Epichlo?gansuensis)；分離于披堿草的雀麥內(nèi)生真菌(E.bromicola)；分離于中華羊茅的內(nèi)生真菌(Epichlo? sp.)；均由蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院提供。

培養(yǎng)基：培養(yǎng)基純化菌株采用PDA培養(yǎng)基，配方為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL。搖瓶種子培養(yǎng)基采用M102[25]，配方為蔗糖30 g，麥芽糖20 g，酵母膏1.0 g，蛋白胨2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，KH2PO41 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1發(fā)酵液的制備 挑取斜面試管菌種的菌絲轉(zhuǎn)接至平板PDA培養(yǎng)基上，22 ℃黑暗培養(yǎng)4周。4周后，用無菌打孔器在菌落邊緣切取3塊6 mm的菌碟，盡量切碎，轉(zhuǎn)入含50 mL/250 mL M102液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，22 ℃搖床培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗，120 r·min-1條件下持續(xù)培養(yǎng)4周，離心后吸取上清液即為內(nèi)生真菌發(fā)酵液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2種子處理 挑選大小一致、籽粒飽滿的(E-)多年生黑麥草種子，將種子浸泡在發(fā)酵液(醉馬草、披堿草、中華羊茅)中，以空白液體培養(yǎng)基中加蒸餾水浸種為對照，置于搖床以120 r·min-1震蕩培養(yǎng)6 h[26]。

1.2.3PEG-6000 脅迫液配制 采用不同質(zhì)量濃度的聚乙二醇(PEG)溶液，形成不同的干旱條件。依據(jù)參考文獻(xiàn)[27-28]的PEG-6000溶液配制公式，配成0(對照)、-0.3、-0.6、-0.9、-1.2 MPa(分別相當(dāng)于0、12.5%、17.6%、21.1%、23.9%的PEG-6000溶液)5個水勢梯度模擬干旱條件。

1.2.4發(fā)芽的基本條件 發(fā)芽試驗參照GB2930-82《牧草種子檢驗規(guī)程》。干旱脅迫試驗采用紙上發(fā)芽(TP)法，將發(fā)酵液處理后的種子擺放到底部墊有兩層濾紙(分別加入5 mL 0、-0.3、-0.6、-0.9、-1.2 MPa的PEG-6000脅迫溶液)培養(yǎng)皿中，濾紙和培養(yǎng)皿均高溫滅菌，置于22 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。各處理均為4個重復(fù)，每個重復(fù)50粒種子，發(fā)芽期為16 d。每天統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)，7 d時統(tǒng)計發(fā)芽勢，16 d后每個處理中隨機選取10株幼苗，測定并記錄其根長和苗長及鮮重和干重，并計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、幼苗含水量、率霉變。

指標(biāo)計算方法：

發(fā)芽率=(正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

種子發(fā)芽勢=(發(fā)芽數(shù)達(dá)高峰的前1/3天數(shù)內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)。

式中：Gt指t時間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt指相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)。

活力指數(shù)=GI×SX。

式中：GI指發(fā)芽指數(shù)，SX指種苗芽的平均長度。

幼苗含水量=(幼苗單株鮮重)-(幼苗單株干重)；

發(fā)霉數(shù)=(發(fā)霉種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 19.0軟件對所測數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果，分別對同一發(fā)酵液浸種下不同處理、同一處理不同發(fā)酵液浸種下多年生黑麥草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、根長和幼苗長等各項指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析。采用Microsoft Excle 2013錄入數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸種對干旱脅迫下種子萌發(fā)的影響

隨著PEG濃度的增加，各處理下黑麥草種子的發(fā)芽率均呈下降趨勢；不同發(fā)酵液浸種與對照的發(fā)芽率相比較差異顯著(P<0.05)；在-0.6～0 MPa間，不同發(fā)酵液浸種種子的發(fā)芽率差異不顯著(P>0.05)，但-0.9 MPa下，醉馬草發(fā)酵液浸種種子的發(fā)芽率顯著(P<0.05)大于其他處理；在-1.2 MPa下，黑麥草種子不萌發(fā)(圖1)。

隨著PEG濃度的增加，對照、披堿草和中華羊茅發(fā)酵液浸種處理下黑麥草種子的發(fā)芽勢呈下降趨勢，而醉馬草發(fā)酵液浸種下種子發(fā)芽勢先增大后減小，且各處理下不同濃度之間發(fā)芽勢差異顯著(P<0.05)；3種發(fā)酵液浸種下種子發(fā)芽勢在0和-0.3 MPa時大于對照，-0.6 MPa時則相反；除-0.3 MPa外不同發(fā)酵液浸種與對照的發(fā)芽勢相比較差異顯著(P<0.05)(圖2)。

隨著PEG濃度的增加，各處理下黑麥草種子的發(fā)芽指數(shù)均呈下降趨勢，且不同濃度之間發(fā)芽指數(shù)差異顯著(P<0.05)；在各PEG濃度下，醉馬草發(fā)酵液浸種下種子發(fā)芽指數(shù)大于對照，在-0.6和-0.9 MPa下，披堿草和中華羊茅發(fā)酵液浸種下種子發(fā)芽指數(shù)小于對照；3種發(fā)酵液浸種下種子發(fā)芽勢在0 MPa時差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

隨著PEG濃度的增加，黑麥草種子的活力指數(shù)均呈下降趨勢，且不同濃度之間活力指數(shù)差異顯著(P<0.05)；不同發(fā)酵液浸種下種子活力指數(shù)在0 MPa均小于對照，而在-0.3 MPa下則反之；在-0.6～-0.9 MPa下，醉馬草發(fā)酵液浸種的種子活力指數(shù)顯著大對照，披堿草和中華羊茅卻反之；醉馬草發(fā)酵液浸種下種子活力指數(shù)在-0.3～-0.9 MPa均為最大值，披堿草和中華羊茅發(fā)酵液浸種下種子活力指數(shù)次之，且差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

圖1 不同發(fā)酵液浸種對黑麥草種子發(fā)芽率的影響Fig. 1 Effects of seed soaking with Epichlo? endophyte fermentation broth on the germination rate in perennial ryegrass seed

不同大寫字母表示相同滲透勢不同發(fā)酵液浸種處理間差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示相同發(fā)酵液不同滲透勢處理間差異顯著(P<0.05)；下同。

Different capital letters indicate significant differences among different fermentation broth soaking seed treatments with the same osmotic potential at the 0.05 level; and different lowercase letters indicate significant differences among different osmotic potentials in the same fermentation broth soaking seed treatment at the 0.05 level; similarly for the following figures.

圖2 不同發(fā)酵液浸種對黑麥草種子發(fā)芽勢的影響Fig. 2 Effects of seed soaking with Epichlo? endophyte fermentation broth on the germination force inperennial ryegrass seed

2.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸種對干旱脅迫下種子霉變的影響

黑麥草種子的霉變率隨著PEG濃度的增加先增大后減小，不同發(fā)酵液浸種下種子霉變率在-0.6 MPa下均達(dá)到最大值，對照在-0.9 MPa下達(dá)到最大值；醉馬草和披堿草內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸種下種子發(fā)霉率顯著小于對照(P<0.05)，而中華羊茅浸種下種子發(fā)霉率與對照差異不顯著(P>0.05)；浸種處理下種子霉變率最低達(dá)到6.6%，對照下種子霉變率最低,為28.3%(圖5)。

2.3 內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸種對干旱脅迫下幼苗及根的影響

2.3.1內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸種對干旱脅迫下幼苗含水量的影響 幼苗含水量隨著PEG濃度的增加而減小，不同真菌發(fā)酵液浸種下幼苗含水量從大到小依次為醉馬草、披堿草、中華羊茅、對照；醉馬草和披堿草發(fā)酵液浸種下幼苗含水量差異不顯著(P>0.05)，顯著高于對照(P<0.05)(圖6)。

圖3 不同發(fā)酵液浸種對黑麥草種子發(fā)芽指數(shù)的影響Fig. 3 Effects of seed soaking with Epichlo? endophyte fermentation broth on the germination index in perennial ryegrass seedd

圖4 不同發(fā)酵液浸種對黑麥草種子活力指數(shù)的影響Fig. 4 Effects of seed soaking with Epichlo? endophyte fermentation broth on the vigor index in perennial ryegrass seed

圖5 不同發(fā)酵液浸種對黑麥草種子霉變率的影響Fig. 5 Effects of seed soaking with Epichlo? endophyte fermentation broth on the seed mildew rate in perennial ryegrass

圖6 不同發(fā)酵液浸種對黑麥草幼苗含水量的影響Fig. 6 Effects of seed soaking with Epichlo? endophyte fermentation broth on the seedling water content in perennial ryegrass

2.3.2內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸種對干旱脅迫下幼苗長和根長的影響 不同發(fā)酵液浸種下黑麥草幼苗長隨著PEG濃度的增加而減小，不同濃度下幼苗長度差異顯著(P<0.05)；在0 MPa下，不同幼苗長度相差不顯著(P>0.05)；不同發(fā)酵液浸種下幼苗長在-0.9～-0.3 MPa均大于對照；醉馬草和披堿草發(fā)酵液浸種下幼苗長度彼此差異不顯著(P>0.05)，且顯著(P<0.05)大于對照(表1)。

隨著PEG濃度的增加，在披堿草、中華羊茅、對照浸種下黑麥草根長先增大后減小，在-0.6 MPa下達(dá)到最大值，且在-0.3和-0.6 MPa間根長差異不顯著(P>0.05)；醉馬草發(fā)酵液浸種下根長隨著PEG濃度的增加而增加，在0 MPa下，其根長顯著(P>0.05)小于披堿草和中華羊茅處理，但在-0.6和-0.9 MPa顯著大于其他浸種處理(表1)。

表1 不同發(fā)酵液預(yù)處理對黑麥草幼苗苗長、根長的影響Table 1 Effect of different seed soaking with Epichlo? endophyte fermentation broth on seeding length and root lengthof perennial ryegrass

3 討論與結(jié)論

在干旱和半干旱地區(qū)，水分是影響種子萌發(fā)的主要因子，PEG-6000因本身不易自由通過植物細(xì)胞壁，不易滲入活細(xì)胞內(nèi)，不會給種子內(nèi)增加營養(yǎng)物質(zhì)，且無毒，但能減緩萌發(fā)初期水分進(jìn)出種子的速率等[29]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著PEG濃度的增加，黑麥草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、幼苗長和幼苗含水量均減小，此結(jié)果與Radhakrishnan等[26]不同溫度和PEG處理對中華羊茅種子萌發(fā)的影響和李會強[1]等于干旱條件下內(nèi)生真菌對多年生黑麥草生長影響的研究結(jié)果一致。在水分虧缺的條件下，具發(fā)達(dá)根系的植株更易存活，因為更深更密的根系能夠提高植株對水分的吸收能力[30]，本研究表明，隨著PEG濃度的增加，不同發(fā)酵液處理下黑麥草根系長度均在-0.6 MPa下達(dá)到最大值，說明水分的變化對可以影響植物的生長特性，而植物可以通過調(diào)節(jié)自身外部形態(tài)變化來適應(yīng)干旱條件。

化感作用是指植物或微生物通過向環(huán)境中釋放某些化學(xué)物質(zhì)或者次生代謝產(chǎn)物從而對其他植物或微生物產(chǎn)生有利或不利的影響[31]，內(nèi)生真菌發(fā)酵液則通過化感效應(yīng)來影響植物的生長發(fā)育。鐘松等[15]采用紙上發(fā)芽法(TP)測定中華羊茅內(nèi)生真菌發(fā)酵液對中華羊茅種子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明40倍稀釋液可明顯提高中華羊茅種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率，促進(jìn)幼苗的生長(P<0.05)，10倍稀釋液能明顯增加其苗鮮質(zhì)量(P<0.05)。張樹武等[32]發(fā)現(xiàn)不同稀釋倍數(shù)深綠木霉發(fā)酵液能夠顯著提高黑麥草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，尤其是100倍稀釋液對黑麥草種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響較明顯。蜜環(huán)菌的代謝產(chǎn)物對油菜籽的萌發(fā)及幼苗的生長存在明顯的化感作用，這種作用對油菜的生長產(chǎn)生了顯著的影響。發(fā)酵液在油菜籽萌發(fā)過程中對種子的發(fā)芽勢影響顯著，對最終種子發(fā)芽率影響不大，可促進(jìn)幼苗伸長[33]。本研究表明，在內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸種下，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、幼苗長、根系和幼苗含水量均顯著大于對照(P<0.05)，表明內(nèi)生真菌的存在可以使黑麥草種子發(fā)芽能力在干旱條件下具有優(yōu)勢，以保證黑麥草在逆境中的生長，證明內(nèi)生真菌通過促進(jìn)幼苗根系的生長進(jìn)而提高黑麥草幼苗含水量，使其在干旱環(huán)境下將更多的水分用于幼苗的生長，從而提高了黑麥草的抗旱性。而李紹鋒等[34]首次發(fā)現(xiàn)豚草(Ambrosiaartemisifolia)種子中含有豐富的內(nèi)生真菌，并且供試的7種內(nèi)生真菌菌株的發(fā)酵液均不同程度地抑制豚草種子發(fā)芽，降低幼苗地上部高度、根長度、根數(shù)量和總生物量，并且不同菌株發(fā)酵液之間抑制程度差異明顯。說明內(nèi)生真菌發(fā)酵液只是通過間接的作用調(diào)控植物的生長，不同的內(nèi)生真菌產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物不同，因此對宿主與非宿主植物影響不同，而其機理尚不十分明確。在無水分脅迫時，各處理黑麥草種子的發(fā)芽勢大小依次為中華羊茅>披堿草>醉馬草>對照，而在-0.3 MPa下，醉馬草發(fā)酵液浸種處理種子的發(fā)芽勢顯著大于其他處理，且隨著干旱脅迫程度的增大發(fā)芽勢先增大后減小，而其他處理下發(fā)芽勢均呈下降趨勢，說明在種子萌發(fā)初期，中華羊茅發(fā)酵液處理比醉馬草發(fā)酵液處理更易受干旱脅迫的影響，出芽整齊度大大降低。種子發(fā)生霉變的因素有好多種，一是溫度過高，導(dǎo)致種子萌發(fā)所需要的酶失活，而后種子死亡，最后霉變；二是水分過多，氧氣不足，種子無法進(jìn)行有氧呼吸，產(chǎn)生了有害物質(zhì)使種子死亡，最后發(fā)霉。但本研究引起種子霉變的主要原因是種子本身沒有經(jīng)過消毒處理，由于微生物的過度繁殖和種子內(nèi)的種傳真菌的作用，使種子發(fā)生霉變，但是霉變并沒有引起種子活力的喪失。這是因為內(nèi)生真菌發(fā)酵液中具有一定含量的抑菌活性物質(zhì)，可有效抑制種傳真菌的侵染。前人研究發(fā)現(xiàn)，離體培養(yǎng)下內(nèi)生真菌具有一定的抑菌活性[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照比較，醉馬草和披堿草發(fā)酵液浸種后種子霉變率降低，而中華羊茅內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸種并未有效降低黑麥草種子的霉變率，這可能是由于離體狀態(tài)下中華羊茅內(nèi)生真菌發(fā)酵液產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)含量較低，或者是其產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)對黑麥草種子表面的種帶真菌的活性較弱導(dǎo)致。

綜上所述，離體禾草內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸種能有效緩解干旱脅迫下黑麥草種子的萌發(fā)和幼苗生長，醉馬草發(fā)酵液浸種將會更好的適應(yīng)干旱環(huán)境。因此可將內(nèi)生真菌發(fā)酵液制成植物保水劑等用來浸種，以提高其非生物脅迫下的萌發(fā)能力，對于離體禾草內(nèi)生真菌的開發(fā)應(yīng)用和田間施用具有一定指導(dǎo)意義。但是，內(nèi)生真菌具體通過什么機理促進(jìn)了種子萌發(fā)來適應(yīng)干旱脅迫還有待于進(jìn)一步深入研究。

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