李 慶(天津市紅橋醫(yī)院皮膚科，天津 300131)

銀屑病是一種多基因遺傳背景下免疫介導(dǎo)的炎癥性皮膚病，其患病率約為0.1%～3%[1]。銀屑病主要病理表現(xiàn)為表皮角化過度伴角化不全，真皮乳頭層毛細(xì)血管擴(kuò)張，炎性細(xì)胞浸潤明顯。銀屑病發(fā)生是以角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖分化和血管增生為病理基礎(chǔ)。研究表明，成纖維細(xì)胞生長因子1(FGF-1)參與了組織器官發(fā)育、傷口愈合、腫瘤發(fā)生等過程[2]；絲裂原活化蛋白激酶-1(MAPK-1)信號通路在銀屑病的發(fā)生和進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用[3]。CD34是血管內(nèi)皮細(xì)胞中的分子標(biāo)志物，它可反映血管新生情況[4]。本研究收集尋常型銀屑病皮損組織及正常皮膚組織，采用免疫組化法及反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)測定其中的FGF-1、MAPK1、CD34蛋白及mRNA表達(dá)水平，以探討三者在尋常銀屑病中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料：收集2015年7月～2016年10月在我院皮膚科接受治療的尋常型銀屑病患者34例的病變皮損作為標(biāo)本，其中男18例，女16例；年齡17～40歲，平均(31.9±4.0)歲；靜止期12例，進(jìn)行期22例；病程1～17年，平均(3.1±0.5)年。患者入院前未進(jìn)行過系統(tǒng)或外用藥物治療，排除伴有系統(tǒng)性疾病患者。所有患者均進(jìn)行銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度評分(PASI)。另外選擇同期在我院外科手術(shù)治療患者的正常皮膚組織34例作為對照，其中男17例，女17例；年齡18～42歲，平均(32.4±4.1)歲。上述所選患者均知情同意。銀屑病組與對照組患者的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2試劑：羊抗人FGF-1多克隆抗體由深圳寶凱侖科技有限公司提供；兔抗人MAPK-1多克隆抗體由上海領(lǐng)成生物科技有限公司提供；即用型兔抗人CD34多克隆抗體由上海滬峰化工有限公司提供；蠟塊RNA提取試劑盒由北京博邁斯科技發(fā)展有限公司提供；反轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒由深圳寶安康生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒由上海國源生物技術(shù)郵箱公司提供；磷酸鹽緩沖液(PBS)、檸檬酸修復(fù)液、DAB顯色液由上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司提供；二乙基焦磷酰胺(DEPC)由上海滬峰化工有限公司提供；其他試劑均由上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1RT-PCR檢測：采用蠟塊RNA提取試劑盒提取總RNA，檢測A260/A280值。加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl、引物0.5 μl、RNA 500 ng，5×RT緩沖液2 μl、,最后加無核酸水至10μl配制成10 μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，置于37℃ 15 min→98℃ 5 min進(jìn)行反應(yīng)。加2×Quick TaqHS Dremix 25 μl、引物1 μl、cDNA 5 μl，最后加無菌三蒸水至50 μl形成50 μl PCR反應(yīng)體系，置于94℃預(yù)變性2 min→94℃變性30 s→Tm-5℃退火30 s→72℃終延伸10 min( 30個循環(huán))。取10 μl獲得的RNA和2 μl緩沖液混合，加入含有0.5 μg/ml溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中，以Tris硼酸緩沖液為電泳緩沖液，恒壓80 V，電泳1.5 h,用凝膠圖像成像分析儀拍片。測量A值、A值比值(即目的基因/β-actin)。

1.3.2組織芯片制備：以熔化石蠟制作空白蠟塊，制作8×7點組織陣列，用穿刺針打孔(內(nèi)徑1.5 mm)。把供體蠟塊置于45℃烘10 min，用定位儀定位組織芯片后用穿刺針取出，并放入預(yù)備好的受體蠟塊內(nèi)，每例取2個組織芯片。把做好的受體蠟塊組織包埋壓平，冷卻后置入72℃烘60 min,再把芯片置入冰箱內(nèi)保存待用。

1.3.3免疫組化(SP)法測定：取備好的組織芯片連續(xù)切片(厚4 μm)，常規(guī)脫蠟，抗原修復(fù)，3%過氧化氫甲醇阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加濃度1∶150的FGF-1、1∶100的MAPK-l和CD34，4℃冰箱內(nèi)過夜。二抗根據(jù)試劑盒操作說明書完成。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，氨水反藍(lán)，脫水，透明，封片，鏡檢。以PBS代替一抗為陰性對照，以所購試劑附帶的銀屑病陽性組織為陽性對照。34例正常皮膚組織為正常對照。FGF-1、MAPK1、CD34表達(dá)于胞質(zhì)，胞質(zhì)染色呈淡黃色至棕黃色時判定為陽性。根據(jù)由兩人雙盲法觀察切片,選取≥5個高倍視野，≥1 000個細(xì)胞，對免疫組化結(jié)果進(jìn)行評估。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比和著色強(qiáng)度進(jìn)行評分：0分：0%；1分：≤10%；2分：11%～50%；3分：51%～75%，4分：>75%。著色強(qiáng)度:0分：不著色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比得分與著色強(qiáng)度得分之和判斷陽性強(qiáng)弱，陰性(-):0分；弱陽性(+):1～2分；陽性(++):3～5分;強(qiáng)陽性(+++):6～7分[4]。

2 結(jié)果

2.1FGF-1、MAPK1、CD34 mRNA相對表達(dá)情況：銀屑病組皮損FGF-1、MAPK1、CD34 mRNA的相對表達(dá)水平明顯高于對照組，差異顯著有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 FGF-1、MAPK1、CD34 mRNA相對表達(dá)情況

2.2FGF-1、MAPK1、CD34蛋白陽性表達(dá)情況：在銀屑病皮損和正常皮膚中均有FGF-1、MAPK1、CD34蛋白表達(dá)，表達(dá)率為100%，但正常皮膚多為弱陽性表達(dá)，而銀屑病皮損陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)的比例明顯高于對照組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 FGF-1、MAPK1、CD34蛋白陽性表達(dá)情況[例(%)]

2.3FGF-1、MAPK1、CD34蛋白陽性表達(dá)與臨床特征的關(guān)系：FGF-1、MAPK1、CD34蛋白陽性表達(dá)與患者性別、年齡無明顯關(guān)系，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，進(jìn)行期、PASI評分≥2.5的患者FGF-1、MAPK1、CD34蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)明顯高于靜止期、PASI評分<2.5的患者，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.4FGF-1表達(dá)與MAPK1、CD34、 PASI評分的關(guān)系：Spearman相關(guān)性分析顯示，F(xiàn)GF-1蛋白表達(dá)與MAPK-1蛋白、CD34蛋白呈正相關(guān)(r=0.723，0.649，P<0.05)，三者與PASI評分均呈正相關(guān)(r=0.724，0.685,0.617，P<0.05)。

表3 FGF-1、MAPK1、CD34蛋白陽性表達(dá)與臨床特征的關(guān)系[例(%)]

3 討論

銀屑病的基本病理改變?yōu)榻琴|(zhì)形成細(xì)胞過度增殖和血管異常增生。大量研究證實，銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖、分化和凋亡是多種信號通路共同參與的一個過程[5]。在這些信號通路中，MAPK信號通路起著重要作用，它是一種絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)蛋白激酶，可把胞外刺激信號經(jīng)級聯(lián)反應(yīng)由胞膜傳入胞核，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理、病理過程。MAPK在人類皮膚中的表達(dá)與銀屑病的發(fā)生有顯著的關(guān)系。FGF-1是成纖維細(xì)胞生長因子成員之一，它廣泛表達(dá)于人類多種組織，也表達(dá)于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等[6]。FGF-1通過結(jié)合細(xì)胞表面受體FGFR-l而使其酪氨酸殘基磷酸化，同時誘發(fā)信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，啟動MAPK信號通路的下游激動因子Raf-1[7]。當(dāng)細(xì)胞表面的FGFR-1識別FGF-1時會提高胞內(nèi)的鈣離子和c-fos等mRNA水平,刺激原癌基因的表達(dá)，引起細(xì)胞過度增殖、分化[8]。

許多研究發(fā)現(xiàn)，CD34、CD31、vWF等是血管細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞表面的分子標(biāo)志物，可用于血管新生的研究[9]。本研究以CD34來對血管新生進(jìn)行評估。研究表明，銀屑病皮損中存在缺氧誘導(dǎo)因子-α、血管內(nèi)皮生長因子等的高表達(dá)，而這些分子與微血管密度密切相關(guān)。FGF-l可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子高表達(dá)，促進(jìn)血管新生，其機(jī)制可能是通過ERKl/2和P38MAPK信號通路實現(xiàn)。故認(rèn)為，F(xiàn)GF-1是經(jīng)非經(jīng)典分泌方式出胞，在通過細(xì)胞表明受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入胞內(nèi)，同時與胞膜上的絡(luò)氨酸磷酸化位點結(jié)合而發(fā)揮信號傳遞作用，從而使DNA合成增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，加速真皮血管的新生，這對銀屑病的發(fā)生起著重要作用。

本研究結(jié)果顯示，銀屑病皮損中FGF-1、MAPK1、CD34 mRNA的相對表達(dá)水平及其蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)率明顯高于正常皮膚，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)GF-1、MAPK1表達(dá)上調(diào)表明，二者可能參與了銀屑病的發(fā)生，而CD34表達(dá)生則表明真皮乳頭層存在血管新生；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行期、PASI評分≥2.5的患者表達(dá)水平更高，說明三者的表達(dá)水平與臨床分期及嚴(yán)重程度有關(guān)，相關(guān)性分析則顯示三者間呈正相關(guān)，且均與PASI評分呈正相關(guān)，因此對三者的檢測可評估銀屑病的嚴(yán)重程度及預(yù)后。

綜上所述，銀屑病皮損存在FGF-1、MAPK1、CD34表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)GF-1、MAPK1可能在銀屑病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖和血管異常新生中起重要作用，且其表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，對其檢測利于評估疾病的嚴(yán)重程度及預(yù)后。

4 參考文獻(xiàn)

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