陳延紳，張廣斌，王春燕，李明春，程艷芹

四味止血片是解放軍第159醫(yī)院自制制劑［濟(jì)制字（2011）F15001］，由益母草、翻白草、地榆、丹參4味中藥制成。具有清熱利澀、解毒消炎、散瘀鎮(zhèn)痛之功效。適用于功能失調(diào)性子宮出血與月經(jīng)過多、月經(jīng)痛的治療?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有益母草和丹參的薄層鑒別，不能全面反映中藥制劑的質(zhì)量。為有效地控制四味止血片的制劑質(zhì)量，該研究在其原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了原標(biāo)準(zhǔn)中益母草、丹參的薄層鑒別方法，增加了地榆的薄層鑒別方法。此外，用HPLC法檢測了制劑中丹參素鈉的含量，為制定具有可操作性、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確可靠的四味止血片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀；DV215CD型電子天平（OHAuS）；FA1604電子分析天平（上海衡平儀器儀表廠）；恒溫水浴鍋（余姚市亞星儀器儀表有限公司）。JM-B2102型電子天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗設(shè)備有限公司）；FA1604型電子分析天平 （上海衡平儀器儀表廠）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；WD-9403型紫外分析儀（北京市六一儀器廠）；電熱恒溫水浴槽（上海南陽儀器有限公司）。

硅膠G薄層板 （自制）；鹽酸水蘇堿對照品（110712-201312）； 益母草對照藥材 （120912-201209）；地榆對照藥材（121286-200402）；丹參對照藥材（120923-201414）均購于中國食品藥品檢定研究院；丹參素鈉對照品（20160302；含量：99．9%，壇墨質(zhì)檢）；四味止血片樣品（20150317，中國人民解放軍第159醫(yī)院）；四味止血片（批號：2017023，20170224，20170225，自制）；陰性樣品為該院自制；水為自制蒸餾水；乙腈（天津四友，一級色譜純）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC（薄層色譜法）鑒別

2.1.1 益母草［1，2］取本品 4 g，除去包衣，研細(xì)，加入70%乙醇溶液50 ml，超聲處理30 min，濾過，蒸干，殘渣加無水乙醇1 ml使溶解，作為供試品溶液；取益母草對照藥材5 g，按照供試品溶液的制備方法制成益母草的對照藥材溶液；取鹽酸水蘇堿對照品適量，加無水乙醇制成每1 ml含2．5 mg的溶液，作為對照品溶液；取缺益母草的陰性樣品3 g，按照供試品溶液的制備方法制成益母草的陰性對照溶液。吸取上述4種溶液各5 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以丙酮-無水乙醇-鹽酸（10∶6∶1）溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液-三氯化鐵試液（10∶1）混合溶液至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 益母草薄層鑒別圖

2.1.2 地榆［1，3］取本品，除去包衣，研細(xì)，取粉末2 g，加10%鹽酸的50%甲醇溶液50 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液用鹽酸飽和的乙醚振搖提取2次，25 ml/次，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液；另取地榆對照藥材2 g，按照供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液；取缺地榆的陰性樣品1 g，按照供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。吸取上述3種溶液各5 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯（用水飽和）-乙酸乙酯-甲酸（6∶2∶1）溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。陰性對照無干擾。結(jié)果見圖2。

圖2 地榆薄層鑒別圖

2.1.3 丹參［1，4］取本品，除去包衣，研細(xì)，取粉末5 g，加水50 ml，加鹽酸調(diào)pH至2，超聲處理30 min，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取2次，30 ml/次，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加無水乙醇1 ml使溶解，作為供試品溶液；取丹參對照藥材1 g，按照供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液；取缺丹參的陰性樣品2．5 g，按照供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。吸取上述3種溶液各5 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶0．5∶2）溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點；陰性對照無干擾。結(jié)果見圖3。

圖3 丹參薄層鑒別圖

2.2 丹參中丹參素鈉的含量測定［5-7］

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent SB-C18（4．6×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-2%冰乙酸溶液（5∶95）；流速 0．8 ml/min；檢測波長 281nm；柱溫 25 ℃；進(jìn)樣量10 μl。理論塔板數(shù)按丹參素鈉峰計算應(yīng)不低于2000。

2.2.2 溶液的制備 （1）對照品溶液。精密稱取丹參素鈉對照品4．98 mg，置5 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得丹參素鈉對照品貯備液 1（995．0 μg/ml，丹參素鈉含量為99．9%）。精密吸取對照品貯備液 1（995．0 μg/ml）1．0 ml，置 5 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得濃度為199．0 μg/ml的丹參素鈉對照品溶液。精密稱取丹參素鈉對照品23．88 mg，置10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得濃度為 2．3856 mg/ml（丹參素鈉含量為 99．9%）的丹參素鈉對照品貯備液2。搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。（2）供試品溶液。取樣品粉末約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，加熱回流60 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。（3）陰性對照溶液。取缺丹參的陰性樣品1 g，按照（2）項下供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各 10 μl，按 2．2．1 項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜峰。結(jié)果供試品溶液中丹參素鈉的保留時間在8．5 min左右，樣品峰與其他組分分離良好，且陰性對照無干擾。結(jié)果見圖4。

圖4 高效液相色譜圖

2.2.4 線性考察 分別精密吸取2．2．2項下對照品溶液 1 （199．0 μg/ml）2 μl、4 μl、8 μl、10 μl、12 μl、16 μl、20 μl，注入液相色譜儀測定，記錄色譜峰。 以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得丹參素鈉回歸方程為：Y=643．55X+8．8697，r=0．9999，n=7。 結(jié) 果 表 明 ， 丹 參 素 鈉 在0．3980～3．9800 μg 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取2．2．2項下配制的對照品溶液 1（199．0 μg/ml）10 μl，注入色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積。結(jié)果丹參素鈉的RSD為0．19%，表明實驗儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液 （批號：20150317），分別于 0、2、4、6、8、12 h 各進(jìn)樣 1 次，每次10 μl，測定其峰面積。 結(jié)果RSD為0．68%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批號的樣品（批號：20150317）粉末 1 g，共 5 份，按 2．2．2 項下方法，制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μl，測定峰面積，并計算每克樣品中丹參素鈉的含量。結(jié)果丹參素鈉平均含量為 4．9301 mg/g，RSD 為 1．66%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量同一批號樣品（批號：20150317）約 0．5 g，共 9 份分別精密加入丹參素鈉對照品（2．3856 mg/ml）1．5、1、0．5 ml，按照2．2．2項下供試品溶液制備方法制成供試品溶液，依法進(jìn)行含量測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 樣品加樣回收試驗結(jié)果（n=9）

2.2.9 含量測定 取3個批次的樣品1 g，各3份，按照2．2．2項下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)行含量測定，計算每1 g四味止血片中丹參素鈉的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

益母草的薄層鑒別中，樣品處理方法采用超聲處理，方法簡便，易于操作。通過多次實驗，在展開劑的比例為丙酮-無水乙醇-鹽酸 （10∶6∶1）的條件下，益母草的薄層點顯色清晰，陰性對照無干擾。丹參的薄層鑒別中，為降低操作中的毒性危害，本實驗改用二氯甲烷為展開劑，降低了操作過程中的毒害性。此外考慮丹參酮Ⅱa為脂溶性成分，制劑提取方法（水提?。┨崛×课?，薄層鑒別特點不明顯，改用丹參對照藥材做對照。

為了能更好地控制四味止血片的質(zhì)量，該實驗在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加了地榆的薄層鑒別項目。本修訂中開始以沒食子酸和地榆藥材做對照，但是陰性對照有干擾，液相也提示四味藥材均含有沒食子酸，所以只用地榆藥材做對照。該實驗還調(diào)整了展開系統(tǒng)的比例為甲苯 （水飽和）-乙酸乙酯-甲酸（6∶2∶1），在此條件下，地榆的薄層點顯色清晰，陰性對照無干擾。

丹參作為四味止血片中主要藥味之一，其有效成分丹參素鈉具有改善血液黏稠、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)等藥理作用，是治療痛經(jīng)、月經(jīng)過多的常用有效成分之一。因此，該次質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂增加了丹參中丹參素鈉的含量測定項。該試驗在考察了樣品提取溶劑的用量、方法、時間等因素后確定了2．2．2項下供試品溶液的制備方法；選擇流動相時，曾嘗試不同比例的乙腈-2%冰醋酸溶液作為流動相，結(jié)果當(dāng)乙腈與2%冰醋酸溶液的比例為5∶95時，樣品峰保留時間合適，與雜質(zhì)峰分離度良好，且峰型較好，陰性對照無干擾。

批號20170223與批號20170224樣品中丹參素鈉的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于批號20150317的含量，究其原因，可能由于原料的批次不一樣導(dǎo)致。

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