楊豪杰，王振宜，劉 華

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肛腸科，上海 200437）

肛腸術(shù)后創(chuàng)面多表現(xiàn)為皮膚潮濕、創(chuàng)面滲液、膿液黏稠較多、肉芽組織淡紅，全國名老中醫(yī)柏連松教授歸之于“濕熱下注”之癥[1-2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為創(chuàng)面紅腫熱痛（局部濕熱）程度與毛細(xì)血管滲出、局部炎癥反應(yīng)、細(xì)菌感染密切相關(guān)，而血管通透性增加是其關(guān)鍵病理改變。最新研究表明Src/VE-cadherin信號通路在調(diào)節(jié)血管通透性，控制炎癥反應(yīng)等方面起著重要作用[3-4]。本研究以SD大鼠肛旁創(chuàng)面模型為研究對象，進(jìn)一步研究清熱利濕方及虎杖苷通過調(diào)控血管通透性促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 采用清潔級SD大鼠108只，雄性，體質(zhì)量（300±50）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物合格證號：SCXK（滬）2012-0002。于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1個(gè)月。

1.2 藥物與試劑 清熱利濕方采用柏連松教授經(jīng)驗(yàn)方，由虎杖20g，蒲公英20g，苦參10g，黃柏10 g組成，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室按比例制備成熏洗液備用（實(shí)際外洗比例為水煎劑:水=1:9）。生理鹽水（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品），虎杖苷（上海同田生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），伊文氏藍(lán)晶體（美國Sigma lifes cience公司產(chǎn)品）。伊文氏藍(lán)溶液的配制方法：稱取伊文氏藍(lán)晶體1g，加入100mL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，溶解后加1mL1%Na2CO3溶液過濾；4℃保存。臨用前取0.1mL，加9.9mL PBS稀釋成0.01%濃度使用。Src、VE-cadherin Elisa試劑檢測盒（上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品，批號E20160901A）。

1.3 儀器 酶標(biāo)儀（epoch，Bio-Tek公司產(chǎn)品）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模及干預(yù) 將大鼠隨機(jī)分為清熱利濕組、虎杖苷組、生理鹽水組，每組36只。參照岑瑛的方法[5]于術(shù)前3 d用8% Na2S脫毛，造模時(shí)用10%水合氯醛麻醉（每100 g 大鼠體質(zhì)量0.4 mL）。使用自制手術(shù)器械在大鼠臀部做直徑1.8 cm，面積為2.54 cm2的圓形切口創(chuàng)面，全層切除皮膚及筋膜直至肌肉表層。止血后放入清潔代謝鋼絲籠內(nèi)飼養(yǎng)，不予包扎任其自然感染，形成肛旁創(chuàng)面模型。術(shù)后24 h起，各組分別用藥物或生理鹽水浸浴治療，2次/d，20 min/次。藥液以沒大鼠創(chuàng)面上3 cm為度，鐵絲籠置40 ℃電熱恒溫水浴箱，待藥液達(dá)40 ℃時(shí)開始外洗。

2.2 取材 每組大鼠中隨機(jī)選取36只，分別于術(shù)后第3、7、11 天每組各選12只取局部創(chuàng)面肉芽組織待用；其中4只行尾靜脈注射伊文氏藍(lán)溶液（30 μg/g，PBS 100 μL /只），30 min后取局部創(chuàng)面肉芽組織待用。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 肉眼觀察 肉眼觀測術(shù)后第3、7、11 d各組創(chuàng)面愈合情況。

2.3.2 血管通透性 將經(jīng)伊文氏藍(lán)染色后的肉芽組織分別精密稱?。?05±5）mg，溶于有機(jī)溶劑Formamide（2 mL）中，室溫下靜置48 h，使用移液器吸取200 μL上清液，置于全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀中（檢測波長420 nm）測量OD值。

2.3.3 Src、VE-cadherin含量測定 測定方法參考Src、VE-cadherin Elisa試劑盒說明書。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，多組計(jì)量資料如服從正態(tài)分布且方差齊，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較用配對t檢驗(yàn)，方差不齊，先校正方差，然后進(jìn)行方差分析；重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；不服從正態(tài)分布者，采用非參數(shù)檢驗(yàn)；組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α = 0.05。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 肉眼觀察 術(shù)后第3天生理鹽水組大鼠創(chuàng)面有較多滲液，創(chuàng)面紅腫，水腫較為明顯；虎杖苷組大鼠創(chuàng)面有少量滲液，明顯少于生理鹽水組，部分創(chuàng)面伴有紅腫；清熱利濕組的滲液基本消失并開始結(jié)痂愈合，未見明顯紅腫，創(chuàng)面水腫不明顯。術(shù)后第7天生理鹽水組大鼠創(chuàng)面仍有少量滲液，且滲液明顯多于其余兩組，創(chuàng)面紅腫較明顯，但較術(shù)后第3天已有明顯改善；虎杖苷組大鼠創(chuàng)面滲液基本消失，創(chuàng)面仍伴有可見紅腫；清熱利濕組的愈合情況較好，創(chuàng)面滲液消失，已基本接近愈合，未見明顯水腫和滲出。術(shù)后第11天生理鹽水組大鼠創(chuàng)面有少量滲液，創(chuàng)面較其余2組紅腫略明顯；虎杖苷組仍有少量滲液，多于清熱利濕組，創(chuàng)面水腫不明顯；清熱利濕組的愈合情況較好，創(chuàng)面滲液消失，未見明顯水腫和滲出。

3.2 血管通透性 經(jīng)單因素方差分析，術(shù)后第3天 3組伊文氏藍(lán)滲出比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后第7，11天3組伊文氏藍(lán)滲出比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故對術(shù)后第3天進(jìn)一步比較。經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，結(jié)果提示術(shù)后第3 天清熱利濕組與虎杖苷組伊文氏藍(lán)滲出情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但二者滲出均少于生理鹽水組（P＜0.05）。見表1。

表1 術(shù)后第3、7、11 天各組伊文氏藍(lán)OD值比較（±s ，n =4）

表1 術(shù)后第3、7、11 天各組伊文氏藍(lán)OD值比較（±s ，n =4）

注：與生理鹽水組比較，# P＜0.05

組 別 第3天 第7天 第11天清熱利濕組 3.65±0.17# 1.28±0.27 1.23±0.19虎杖苷組 3.72±0.12# 1.26±0.32 1.25±0.14生理鹽水組 4.07±0.21 1.69±0.65 1.27±0.21

3.3 Src、VE-cadherin含量 Elisa法檢測各組創(chuàng)面肉芽組織中Src、VE-cadherin含量。Elisa結(jié)果顯示術(shù)后第3、7、11天各組肉芽組織中Src濃度均存在明顯差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。術(shù)后第3、7天，生理鹽水組Src濃度大于其他2組（P＜0.05），清熱利濕組與虎杖苷組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后第11天，生理鹽水組的Src濃度大于其他2組的Src濃度（P＜0.05），虎杖苷組Src濃度大于清熱利濕組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組肉芽組織Src濃度變化（±s ，n = 4） pg/mL

表2 各組肉芽組織Src濃度變化（±s ，n = 4） pg/mL

注：與生理鹽水組比較，# P＜0.05，與虎杖苷組比較，△P＜0.05

組 別 第3天 第7天 第11天生理鹽水組 4.66±0.08 4.45±0.20 3.89±0.27清熱利濕組 3.81±0.31# 3.23±0.56# 2.84±0.23#△虎杖苷組 4.07±0.20# 3.58±0.04# 3.35±0.17#

Elisa結(jié)果顯示術(shù)后第3、7天各組肉芽組織中VE-cadherin濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后第11天，生理鹽水組的VE-cadherin濃度低于其他2組（P＜0.05），虎杖苷組VE-cadherin濃度低于清熱利濕組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組肉芽組織VE-cadherin濃度變化（，n = 4pg/mL

表3 各組肉芽組織VE-cadherin濃度變化（，n = 4pg/mL

注：與生理鹽水組比較，# P＜0.05，與虎杖苷組比較，△P＜0.05

組 別 第3天 第7天 第11天生理鹽水組 4.09±0.20 4.27±0.16 4.60±0.09清熱利濕組 4.22±0.05 4.78±0.38 7.23±1.10#△虎杖苷組 4.08±0.20 4.38±0.26 5.67±0.28#

其中Src標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線：Y=0.264X+0.118，R2=0.962；VE-cadherin標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線：Y=0.32X+0.21，R2=0.971。通過450 nm波長測量所得的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出相應(yīng)濃度后，乘以稀釋倍數(shù)（5倍），即為實(shí)際樣品濃度。

3 討論

創(chuàng)面炎癥滲出等濕熱證象的現(xiàn)代病理學(xué)關(guān)鍵是血管通透性增加。通透性過度在臨床上表現(xiàn)滲出增多，不利于創(chuàng)面愈合。血管內(nèi)皮鈣黏附素（VE-cadherin）是血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附連接的主要成分，受Src調(diào)控。當(dāng)Src分泌增多或活性增強(qiáng)，將使VE-cadherin 磷酸化后重新分布，使得內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接松脫，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間縫隙加大，血管通透性提高。反之內(nèi)皮細(xì)胞連接緊密，通透性降低[6-7]。因此，Src/VE-cadherin 信號通路在血管通透性中的作用受到高度重視。課題組前期在總結(jié)柏連松教授清熱利濕方外洗方基礎(chǔ)上，開展了一系列臨床與實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)清熱利濕方外洗能有效改善患者傷口濕熱滲出癥狀，促進(jìn)愈合[8-11]。進(jìn)一步研究清熱利濕方及其有效成分通過調(diào)控血管通透性促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制具有重要意義。

本研究通過肉眼觀察發(fā)現(xiàn)與生理鹽水相比，清熱利濕方與虎杖苷均能更有效控制創(chuàng)面炎性滲出，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。伊文氏藍(lán)染色法結(jié)果與肉眼觀察結(jié)果一致，清熱利濕方與虎杖苷均能降低血管通透性，進(jìn)而控制局部炎癥，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。這一發(fā)現(xiàn)提示清熱利濕方及虎杖苷可能通過調(diào)控Src/VE-cadherin信號通路，降低局部創(chuàng)面通透性，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。因此課題組以Elisa法檢測其對創(chuàng)面肉芽組織Src、VE-cadherin細(xì)胞因子表達(dá)的動(dòng)態(tài)影響，旨在初步驗(yàn)證這一假說。結(jié)果表明清熱利濕方與虎杖苷均能抑制創(chuàng)面組織Src表達(dá)，清熱利濕方效果更佳。此外，結(jié)果還表明清熱利濕方與虎杖苷并不能非常有效提高創(chuàng)面組織VE-cadherin表達(dá)。Src/VE-cadherin信號通路是具有多生物學(xué)效性的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[12-15]，受血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、血管生成素I（AngI）等多種細(xì)胞因子的調(diào)控[16-18]。本研究初步發(fā)現(xiàn)清熱利濕方與虎杖苷主要通過抑制Src表達(dá)，調(diào)控Src/VE-cadherin信號通路，但其確切的作用機(jī)制仍懸而未決。此外，中醫(yī)復(fù)方是一個(gè)高度復(fù)雜的化學(xué)物體體系，清熱利濕方中的中藥活性成分可通過作用于多個(gè)靶點(diǎn)，影響多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。除了虎杖苷，其他有效成分的作用機(jī)制及相互影響仍有待進(jìn)一步研究。

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