郭曉強，桂耀庭

北京大學深圳醫(yī)院， 廣東 深圳 518036

對科學而言，技術(shù)革新是推動理論發(fā)展不可或缺的一環(huán)。凝膠電泳和基因打靶兩項技術(shù)的發(fā)明推動了生命科學領域的快速發(fā)展，業(yè)已成為今天許多實驗室的常規(guī)方法。特別是，這兩項重要的技術(shù)由同一位科學家完成發(fā)明，他就是英國裔美國分子生物學家奧利弗·史密斯(Oliver Smithies)(圖1)。

圖1 史密斯(Oliver Smithies, 1925—2017)

1 幸福童年

1925年6月23日，史密斯與雙胞胎弟弟羅杰(Roger)出生于英格蘭約克郡哈利法克斯(Halifax)的一個中產(chǎn)家庭，父親是一位保險推銷員，母親是一位教師[1]。較為舒適的家庭環(huán)境為史密斯的成長提供了良好的氛圍。史密斯跟隨父親培養(yǎng)出嚴密的邏輯思維能力，又從母親那里歷練出良好的語言表達能力，最重要的是還從祖父那里學到“勤儉”的精神，時刻注意將“廢物”實現(xiàn)重新利用。這一能力伴隨史密斯終生，對他的科研生涯具有重要影響，許多實驗室儀器都是史密斯利用廢棄品自己動手組裝而成的[2]。

童年時史密斯對科學并無太大興趣，一方面父母并不具備這方面的背景，另一方面當時的小學課程也并未開設科學課。史密斯是通過閱讀一本課外漫畫書接觸科學的，他被書中發(fā)明家的故事深深吸引，逐漸對科學產(chǎn)生了興趣。有意思的是，這一啟蒙事件使史密斯更多地成為發(fā)明家而非僅僅停留在理論方面的研究。此外，史密斯在后來能成為偉大的發(fā)明家還源于他與生俱來的一種天賦，即動手能力。他兒時的愛好之一就是親自動手拆解和組裝，從最初簡單的木制小火車、潤滑輪等到后來的收音機和望遠鏡等復雜裝置，所以，史密斯的學生生涯更多體現(xiàn)的是偉大發(fā)明家的角色[3]。

史密斯原本有一個非常幸福的童年，但由于7歲時患上風濕熱而蒙上些許陰影。他被禁止做過多的戶外運動，意味著不得不經(jīng)常待在家里，因禍得福的是他因此有更多的時間用于閱讀，特別是那本具有啟蒙意義的漫畫書[4]。就這樣，史密斯完成了他的初等教育。

2 生物化學

史密斯完成高中學業(yè)后幸運地獲得了一份牛津大學的獎學金，因此得以進入牛津大學貝利奧爾學院(Balliol College)學習。史密斯最初專長的是物理和化學，然而當時正值第二次世界大戰(zhàn)，原想成為物理學家的史密斯為了將來能幫助更多的人而選擇了醫(yī)學。他一方面學習了基礎醫(yī)學的相關(guān)課程，另一方面還掌握了化學、解剖學和生理學等知識。隨著學習的深入，他的思想也日趨成熟，更想做一些帶有挑戰(zhàn)性的工作，因此兩年后，當需要再次選擇繼續(xù)臨床醫(yī)學的學習還是其他課程時，史密斯選擇了后者。

恰在此時，史密斯遇到剛從二戰(zhàn)服役歸來的著名生物化學家奧格斯頓(Alexander George Ogston)。奧格斯頓主要從事生物系統(tǒng)熱力學方面的研究，并于1955年當選為英國皇家學會會員。他成為史密斯人生道路上重要的良師益友，正是他將史密斯帶入科學的殿堂。當奧格斯頓將化學方法研究生物學問題的科學思想娓娓道來時，史密斯被深深吸引，并發(fā)現(xiàn)這就是自己夢寐以求的興趣所在，于是毅然決定追隨奧格斯頓的道路。在完成本科學業(yè)后，他就加入奧格斯頓實驗室從事研究生階段的學習。

史密斯選擇的課題是通過測量溶液滲透壓來確定蛋白純度。通過前期完美的實驗設計和后期不斷的修改和完善，并經(jīng)過兩年多時間反復測試，他最終實現(xiàn)了預定目標。遺憾的是，史密斯發(fā)現(xiàn)自己發(fā)明的這種方法過于繁瑣，即使是自己在實際工作中也不愿使用，更不要說被其他研究者采用。盡管有點小“失落”，他仍然對自己的研究非常滿意，因為自身憑此經(jīng)歷了嚴格的科學訓練，并具備了嚴密的科研思維。1952年，史密斯獲得博士學位。

奧格斯頓還是史密斯科研成長中的摯友。奧格斯頓特別強調(diào)科研過程中的思考和分析，而不是重復和跟風。他為史密斯樹立了正確的科學態(tài)度，那就是科學不僅僅為了尋求真理，也不僅僅是一項智力挑戰(zhàn)，更不單單是一份簡單工作，科學更多的是一種生活方式，不同見解的人由于相同興趣和目標而聚集構(gòu)成科研小家庭(實驗室)，大家都是其中平等的一員，共同為科學付出并分享成功的喜悅[5]。史密斯就是帶著這種理念從科研中享受樂趣。當史密斯取得博士學位后，奧格斯頓建議他能到國外工作以拓展視野，首選地是美國。史密斯原本想留在英國繼續(xù)工作，但在奧格斯頓的執(zhí)意堅持下，最終決定去美國從事博士后研究。

史密斯來到美國的第一站是威斯康辛大學物理化學系，在這里他結(jié)識了自己的第一任妻子。由于簽證和獎學金到期，史密斯不得不離開美國，原本準備回國的他由于妻子的緣故而來到了加拿大[6]。1954年，史密斯進入多倫多大學斯科特(David Scott)實驗室。斯科特是一位著名的胰島素研究專家，他建議史密斯可以從事與胰島素相關(guān)的任何研究，因而史密斯決定分離和鑒定胰島素前體蛋白。

3 蛋白電泳

胰島素是一種蛋白質(zhì)，一般帶負電荷，在電場中可以移動。由于不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子量的差異導致游動速度不同，從而可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)分離，這一原理稱為電泳(electrophoresis)。最早成功將電泳應用于蛋白質(zhì)分離的是瑞典科學家蒂塞利烏斯(Arne Tiselius)，由于他將血清蛋白分離出5種成分而榮獲1948年諾貝爾化學獎。然而這種電泳的缺陷顯而易見，那就是分辨率低(界面不易固定)、蛋白檢測繁瑣等，因此科學家開始對這種方法進行完善。第一個重大突破是1952年開發(fā)出的紙電泳，將傳統(tǒng)的液體支持物改為固體，這在當時是一個極大的改進。史密斯關(guān)于電泳的故事也從此開始。

史密斯在使用紙電泳進行胰島素前體蛋白分離時遇到一個重大難題，由于紙對胰島素前體蛋白具有強的吸附作用，即使通電也無法驅(qū)動其正常移動，因此難以有效分離。1954年初，史密斯到多倫多兒童醫(yī)院薩斯-科特薩克(Andrew Sass-Kortsak)實驗室訪問，參觀了一種新開發(fā)的電泳，該電泳使用淀粉顆粒作為支持物，而蛋白質(zhì)可在淀粉粒間移動。這一新電泳方法可避免紙電泳的吸附作用，但史密斯利用這項新技術(shù)時又面臨新的困難——那就是繁瑣的蛋白質(zhì)檢測。由于濕的淀粉顆粒無法像紙那樣直接染色，因此史密斯不得不將淀粉均分為40份，逐一檢測所含蛋白質(zhì)。這一難題促使他開始了新的思考，那就是能否將紙電泳檢測的便利性和淀粉顆粒電泳的低吸附性合二為一。

史密斯突然回憶起兒時幫媽媽在廚房勞動時曾觀察到淀粉加熱可形成糊狀結(jié)構(gòu)，冷卻后變成“果凍”樣透明膠狀物。他立刻動手制備了簡易電泳槽，先加熱淀粉使其液化，隨后倒入電泳槽，擴散形成特定形狀，經(jīng)冷卻后產(chǎn)生一個完整的膠狀結(jié)構(gòu)。然后史密斯在這種膠狀物上進行電泳[7]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)帶點蛋白質(zhì)可均勻移動(無吸附性)，并且可采用紙電泳那種簡易的蛋白質(zhì)檢測方式。

淀粉凝膠的發(fā)明極大地推動了固相電泳的研究步伐。1959年出現(xiàn)丙烯酰胺凝膠(acrylamide gel)作為介質(zhì)的固相電泳；1966年又出現(xiàn)瓊脂糖凝膠；1969年蛋白質(zhì)變性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)進入蛋白電泳，從而消除了蛋白質(zhì)本身電荷對電泳速度的影響，電泳速度僅與蛋白分子量相關(guān)，成為實驗室常規(guī)實驗之一；20世紀70年代出現(xiàn)高分辨率瓊脂糖電泳；80年代出現(xiàn)毛細管電泳；等等。今天，生命科學實驗室的學生最常用的分離蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳或分離DNA的瓊脂糖凝膠電泳(圖2)，都是從史密斯1954年的發(fā)明基礎上衍生而來。史密斯也憑借這項成就榮獲1990年加拿大加德納國際獎(Gairdner International Award)。

4 血液疾病

史密斯接下來考慮淀粉凝膠電泳的實用性。他借鑒了蒂塞利烏斯最初的做法，使用容易獲取的血清進行蛋白分離。出乎意料的是，蒂塞利烏斯當初只鑒定出5種血清蛋白，而這種新型電泳卻分離出11種成分。這一結(jié)果說明新方法分辨率更高，將更有利于發(fā)現(xiàn)全新蛋白。這一發(fā)現(xiàn)使史密斯放棄胰島素前體蛋白的研究，專心致力于血清蛋白。

史密斯使用淀粉凝膠電泳鑒定出一種新血清蛋白——結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin, Hp)。結(jié)合珠蛋白包含兩種亞基，分別為α亞基和β亞基，β亞基比較穩(wěn)定，α亞基則存在諸多變異。史密斯最初發(fā)現(xiàn)人類存在兩種α亞基，稱為Hp1和Hp2，其中Hp2分子量大于Hp1。進一步研究發(fā)現(xiàn)Hp1又有兩種形式，它們在電泳時速度存在差異，據(jù)此稱為快Hp1(Hp1 fast, Hp1F)和慢Hp1(Hp1 slow, Hp1S)[8]。史密斯對它們之間的聯(lián)系迷惑不解。通過對三者氨基酸組成、N和C端氨基酸分析以及部分酶解肽段的圖譜分析發(fā)現(xiàn)，Hp1F和Hp1S基本相同，而Hp2中既包含Hp1F又包含Hp1S組分。在綜合相關(guān)信息的基礎上，史密斯大膽提出假說，認為Hp2基因是Hp1F和Hp1S通過非同源連接方式而成(圖3)[9]，成為第一個發(fā)現(xiàn)人基因非同源重組現(xiàn)象的科學家。

圖2 凝膠電泳

1960年，史密斯重新回到威斯康辛大學并擔任遺傳學助理教授，3年后提升為教授。隨著對基因和遺傳重組研究與理解的深入，他的興趣也逐漸從蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)向DNA[10]，開始重點研究一種常見的血液系統(tǒng)遺傳病——地中海貧血，而這是源于β-珠蛋白基因突變造成攜氧功能下降的疾病。1980年，史密斯克隆成功β-和γ-珠蛋白基因，并建立完善的基因克隆和分析平臺，為進一步的工作奠定了堅實基礎。

圖3 非同源末端連接

史密斯嘗試利用遺傳學方法治愈地中海貧血，并決定采用同源重組策略，即用正常的β-珠蛋白基因替換患者突變的β-珠蛋白基因[11]。同源重組于1946年首先在細菌中發(fā)現(xiàn)，是指同源基因間可發(fā)生DNA片段交換的現(xiàn)象，20世紀70年代酵母等真核生物中也鑒定出同源重組，然而哺乳動物細胞中能否完成外源基因的精確替換尚未可知[12]。

5 基因校正

1982年，史密斯在準備一篇講解論文時突發(fā)靈感，并因此開啟了自己科研的第二春。論文中利用膀胱癌細胞鑒定癌基因，是20世紀80年代初的一個科研熱點。引起史密斯興趣的是論文中引入一種利用互補原理鑒定基因重組的策略，而經(jīng)過適當修改他構(gòu)思出一個“基因替換”的實驗方案。已近花甲之年的史密斯依然斗志昂揚，在他看來科研只關(guān)激情，不關(guān)年齡[13]，因此決定實施這個當時大多數(shù)研究者看來“無稽之談”的想法。

為證明自己想法的可行性，史密斯首先選擇論文中使用的人膀胱癌細胞進行測試。然而遺憾的是，當將目的DNA轉(zhuǎn)入細胞后卻并未獲得預期效果，即基因替換。他的一位博士后提醒，β-珠蛋白表達具有細胞特異性，是紅細胞專屬功能，膀胱癌細胞本身并不表達，因此即使發(fā)生DNA片段替換，由于基因不表達也將無法篩選。所以，這次失敗并非試驗設計問題，更多的是材料選擇的緣故。為解決這一問題，史密斯隨后用表達β-珠蛋白的小鼠紅白血病細胞進行測試。然而他卻再次遇到麻煩，紅白血病細胞不像膀胱癌細胞那樣貼在培養(yǎng)皿表面生長，而是懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)部增殖，這一特性導致實驗室已有的基因?qū)敕椒ㄊ?。史密斯不得不改用電轉(zhuǎn)移導入策略，但當時電轉(zhuǎn)移儀尚未商業(yè)化。這顯然難不倒史密斯，他充分利用自身先天的“變廢為寶”的能力，親自用實驗室中已有的材料改裝出一個簡易版電轉(zhuǎn)移儀，該儀器后來在實驗室里應用了很長時間。

借用電轉(zhuǎn)移策略將攜帶重組片段的DNA導入紅白血病細胞，剩下的事情就是檢測轉(zhuǎn)染效率和重組效率?？上驳氖?，史密斯這次成功了！在轉(zhuǎn)基因哺乳動物細胞中第一次檢測到外源基因和內(nèi)源基因間的同源重組[14]，將突變的β-珠蛋白基因完成了糾正(圖4)，證明自己當初的想法并非“異想天開”。幾乎同時，意大利裔美國科學家卡佩奇(Mario Capecchi)也完成哺乳動物細胞的同源重組，并成功將一個正常基因精準實現(xiàn)突變。史密斯的整個工作歷時3年，當文章發(fā)表時，他已滿60歲。

然而挑戰(zhàn)接踵而來，盡管哺乳動物細胞可以實現(xiàn)突變基因糾正，但效率極低，每百萬個細胞才有一個細胞完成，這一結(jié)果意味著該策略在臨床疾病治療中幾無用途。史密斯再次遇到博士期間的尷尬，設計出了完美的技術(shù)，但不具有實用性。

6 動物模型

史密斯并未放棄對基因糾正的研究。一方面他們選擇了一個更為理想的研究體系，即次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine phosphoribosyltransferase, HPRT)。該體系的優(yōu)勢在于可利用藥物篩選高效區(qū)分同源重組細胞和未重組細胞，從而加快研究進程和增加同源重組效率。另一方面，史密斯不久獲悉英國發(fā)育生物學家埃文斯(Martin Evans)成功分離出小鼠胚胎干細胞(embryonic stem, ES)，并使用這種細胞制備出健康小鼠。史密斯對這個進展異常興奮， ES的快速增殖可解決同源重組低的問題，更為重要的是還可制備出理想的疾病動物模型——既有利于從整體水平研究疾病發(fā)生機制，又有利于更好地開展藥物測試。1985年11月，埃文斯贈送給史密斯些許ES細胞。

史密斯利用HPRT同源重組體系和ES細胞，最終于1987年成功實現(xiàn)精準修復小鼠Hprt突變基因的目標[15]，而且效率得到極大提升。幾乎同時，卡佩奇和埃文斯等多個小組也在小鼠層面證明基因打靶的可行性，標志著一個全新研究領域的誕生。

圖4 基因替換

史密斯敏銳地意識到基因打靶技術(shù)在人類疾病模型建立和機制研究方面的巨大應用潛力(圖5)。1992年，史密斯等成功建立囊性纖維化小鼠模型[16]，后續(xù)又建立一系列高血壓和動脈粥樣硬化等模型[17]，極大地推動了相關(guān)領域的研究進程。

由于這項成就，史密斯于1993年再次獲得加拿大加德納國際獎，2001年與卡佩奇和埃文斯分享美國拉斯克基礎醫(yī)學獎，2007年三人最終分享諾貝爾生理學或醫(yī)學獎?；虼虬屑夹g(shù)的發(fā)明和基因敲除小鼠的出現(xiàn)極大革新了生命科學研究領域，提升了對癌癥、肥胖、糖尿病等發(fā)生機制的理解和認識，也為新藥篩選和毒理學研究提供了重要工具。

圖5 小鼠模型(左：正常；右：基因打靶)

7 鐘愛一生

1988年，史密斯離開威斯康辛大學，加入北卡羅萊納大學教堂山分校。他興趣廣泛，愛好飛行、作曲等，特別鐘愛德國作曲家巴赫(Johann Sebastian Bach)的作品[4]，顯示出很好的人文素養(yǎng)。2017年1月10日，史密斯在北卡羅萊納州的家中去世，享年91歲。他去世后，多個報刊和雜志刊發(fā)了訃告[2,13,17-20]，同事、好友等都對這位偉大的科學家給予極高評價。

史密斯的成就為他贏得諸多榮譽，他是美國科學院院士(1971年)、美國文理學院院士(1978年)、美國醫(yī)學科學院院士(2003年)和英國皇家學會會員(1998年)等，除上文提及的獎項外，他還獲得以色列沃爾夫醫(yī)學獎(2003年)、March of Dimes 獎(2005年)和美國遺傳學會摩爾根獎章(2007年)等。對這些榮譽史密斯并不太在意，反而擔心會影響他專心于科學研究[4]。

史密斯對生命科學可以說是發(fā)自內(nèi)心的摯愛。他幾十年如一日躬耕于實驗室，并親自操作實驗和制作儀器。在生命科學發(fā)展史上，在群星閃耀的科學殿堂，他算不上最聰明的科學家，但絕對算得上是一位勤奮型大師。史密斯在一定程度上可與兩度獲得諾貝爾化學獎的桑格(Frederick Sanger, 1918—2013)媲美，他們一生都摯愛實驗科學，而且都取得兩項偉大成果。唯一不同在于史密斯只獲得一次諾貝爾獎，但不得不說凝膠電泳的發(fā)明也具有重大的科學價值。

史密斯是一位較為純粹的科學家，他的科研生涯集中體現(xiàn)了古典科學家的幾大特征：首先摯愛科學(為了科學研究)，其次享受過程(親自動手實驗)，三是敢于挑戰(zhàn)(直面科學難題)，四是淡泊名利(發(fā)明免費應用)。在科學日益商業(yè)化的今天，這樣的科學家越來越稀缺。史密斯的另一大特征是嚴格撰寫實驗記錄，幾十年如一日，這種堅持和執(zhí)著更為難得。

史密斯的職業(yè)生涯還表明，一個人永遠不會因為年齡太大而不能享受科學(史密斯去世前不久仍堅持在實驗室)。在他眼中，只要追逐夢想，理想總會實現(xiàn)。借用火箭隊前主帥湯姆賈諾維奇的一句名言：不要低估一顆總冠軍的心。

(2017年8月30日收稿)■

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