陳傳平，吳劍峰，夏和先，陳乃東

(1.皖西衛(wèi)生職業(yè)學院，安徽 六安 237005；2.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012)

黃酮類化合物作為一類重要的天然產(chǎn)物，具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抑菌、抑制自由基的生成以及降低脂質過氧化等[1-2]。金櫻子(RosalaevigataMichx)，系薔薇科薔薇屬常綠灌木的果實，其中所含的黃酮類化合物，也具有抗氧化[3]、降低大鼠全血黏度及抑制血小板聚集等作用[4]。

氧化應激是由于體內氧化性物質與抗氧化性物質之間的失平衡，引起體內氧化性物質濃度過大而導致的損害[5],而與氧化應激密切相關的活性氧(ROS)作為調節(jié)血管功能的重要信號分子，一直是近年來高血壓研究的熱點[6]?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，過量的ROS是機體氧化損傷重要因素之一，正常生理狀態(tài)下，機體代謝過程中產(chǎn)生的ROS與其清除抑制劑處于動態(tài)平衡。當體內產(chǎn)生過量的ROS時，會使多不飽和脂肪酸過氧化而生成脂質過氧化物，MDA是脂質過氧化物的最終產(chǎn)物，它能使蛋白質、核酸、脂類發(fā)生交聯(lián)，生物膜變性、衰老或死亡等[7]。因此，測定MDA能反映機體脂質過氧化的程度，間接地反映細胞損傷的程度。細胞內存在清除ROS的體系如SOD，能促使超氧化物陰離子變?yōu)镠2O2和O2，使細胞免受損傷。因此SOD活性降低能夠反映體內組織細胞ROS清除能力下降、抗氧化反應降低、損傷加重[8]。CAT是過氧化物酶體的標志酶，其主要作用是催化H2O2，清除體內的過氧化氫，減輕和阻斷脂質過氧化作用，預防ROS導致疾病的發(fā)生[9]。GSH-px在體內能使形成的ROS進行原位解毒，過氧化氫分解，減少羥自由基的產(chǎn)生，還可使有害的脂質過氧化物分解成相應的醇類。血管內皮具有維持血管張力、參與管壁炎癥修復、調節(jié)血管生長等多種重要的生理功能，正常血管里NO由內皮細胞產(chǎn)生，作用在平滑肌細胞上，起到舒張血管的作用[10]，NOS為催化內源性NO生成的關鍵酶，原發(fā)性高血壓患者的基礎NO釋放減少，與內皮功能障礙有關，因此NO-NOS體系對心血管疾病的發(fā)生發(fā)展及相關機制的影響也逐漸為研究者關注[11]。

氧化應激產(chǎn)生的活性氧參與血管內皮損傷的多個環(huán)節(jié)，保護血管內皮功能成為防治血管性疾病的關鍵環(huán)節(jié)[12]。體外實驗表明，金櫻子黃酮類化合物，能明顯消除超氧陰離子自由基，抑制羥自由基對細胞膜的破壞而引起的溶血和脂質過氧化產(chǎn)物的形成[13]；乙醇提取物(粗黃酮)能顯著降低血清病型腎炎模型大鼠尿蛋白、血清肌酐和尿素氮水平，以及升高血清總蛋白含量、抗動脈粥樣硬化，減輕腎組織的病理變化[14]。曹運長等報道了金櫻子總黃酮對體外培養(yǎng)的過氧化氫誘導的氧化損傷人臍靜脈內皮細胞具有一定的保護作用[15]，本實驗采用建立大鼠血管百草枯氧化應激損傷模型[16]，進一步考察了金櫻子總黃酮在體內對血管氧化損傷的內皮功能影響，為金櫻子黃酮的生物活性及藥用價值提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗材料：金櫻子，2015年11月采自安徽省金寨縣，品種經(jīng)皖西學院生物與制藥工程學院陳乃東博士鑒定為金櫻子(RosalaevigataMichx)。粉碎后用60%乙醇作提取劑提取、大孔吸附樹脂純化得精制金櫻子總黃酮[17]，純度 73.56%，冷凍干燥備用。

實驗動物：清潔級雄性Wistar大鼠40只，7 w齡，體重250～300 g，由皖南醫(yī)學院實驗動物研究中心提供，動物合格證號SCXK(皖)2016-0022。在23 ℃、相對濕度60%～70%、光照周期12 h:12 h環(huán)境中適應飼養(yǎng)1 w后用于實驗。

主要儀器：3100型全自動生化分析儀(Hitachi公司)，RM2245型切片機(上海萊卡公司)，K500型數(shù)碼顯微鏡(廈門Motic公司)，MadLab-4c生物信號采集處理系統(tǒng)(北京眾實迪創(chuàng)公司)、JZ100肌肉張力換能器(上海益聯(lián)醫(yī)學儀器公司)，離體血管環(huán)裝置(上海唐衡電子公司)，TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器公司)，TGL-20M臺式高速冷凍離心機(長沙平凡儀器儀表公司)，GL-20G-Ⅱ電子分析天平(上海安亭科學儀器廠)，等。

主要試劑：百草枯(Paraquat，批號STBB6713V，上海Sigma公司分裝)；測定試劑盒：超氧化物歧化酶(SOD)(批號：20160415147)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)(批號：20160312231)、過氧化氫酶(CAT)(批號：20160422125)、丙二醛(MDA)(批號：20160410115)，一氧化氮(NO)(批號：20160319052)及一氧化氮合酶(NOS)(批號：20160321021)，由上海榮盛生物藥業(yè)公司提供；HE染色試劑盒(上海奧威生物公司)；乙酰膽堿(Ach)(批號：20160415147，杭州圣隆生物科技公司)；Kerb’s 液(pH 7.4)，按如下配制(mmol / L)：NaCl 117、KCl 4.75、KH2PO41.19、NaHCO325、CaCl2·2H2O 2.54、MgSO4·7H2O 1.19及葡萄糖10.0[11]，現(xiàn)配現(xiàn)用；所有試劑均為AR。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組與給藥

將40只大鼠按體重隨機分為5組(n=8)：正常對照組、百草枯模型組、黃酮干預低、中、高劑量組。分組后各組喂正常飼料，自由飲水，百草枯模型組及黃酮干預組按10 mg/kg·w-1劑量ip百草枯，對照組ip等體積生理鹽水，同時黃酮干預組每天下午2點按25 mg/kg、50 mg/kg及100 mg/kg劑量ig不同金櫻子黃酮(用60%酒精溶解后，再用生理鹽水配制成500 mg/L基礎液)，對照組和百草枯模型組ig等體積蒸餾水，連續(xù)12 w。

1.2.2 血清相關指標測定

1.2.3 腹主動脈病理學觀察

采血后，斷頭處死大鼠，打開胸腹腔，沿橫膈處向下1.5 cm分離腹主動脈，表面粘連的結締組織去除后，一部分置于10中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，按厚度5 μm水平橫切，脫蠟后用HE試劑盒染色，400倍光鏡觀察拍照。剩余腹主動脈置0 ℃的Kerb’s液中，用于測定血管環(huán)張力。

1.2.4 主動脈離體血管環(huán)張力測定

將動脈剪切成約5 mm的環(huán)形標本，懸掛于含10 mL Kerb’s 液(37℃)的浴槽中，通以含5CO2+95O2的混合氣體于飽和處理的4 ℃ Krebs液中，血管環(huán)的一端掛在塑料支架下面的鐵鉤上，另一端連接于張力換能器，連續(xù)通混合氣體，血管環(huán)的一端連接于張力換能器，記錄血管環(huán)張力的變化。血管環(huán)的基礎張力為0.5 g，平衡40 min后，用濃度為6×10-4mol/L KCL溶液收縮血管環(huán)15 min，收縮穩(wěn)定后用Kerb’s 液沖洗至基線，穩(wěn)定1 h后開始實驗。分別用濃度為1×10-12mol/L～1×10-6mol/L的乙酰膽堿 (Ach)使收縮的血管舒張，每隔20min換一次濃度梯度，靜息負荷0.5 g，平衡40 min。以6×10-4mol/L的KCL誘發(fā)的血管收縮幅度為100%，舒張率(%)= Ach引起舒張的張力/KCL引起的收縮張力×100%，以血管張力恢復到KCL前的水平為100%舒張。血管平滑肌的張力變化通過張力換能器將信號傳送到Powerlab軟件系統(tǒng)，記錄血管環(huán)張力變化數(shù)值來表示[18-19]。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，組內前后比較用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。檢驗結果以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 血清相關生化指標測定結果

各組大鼠血清中MDA和NO水平、SOD、GSH-Px、CAT及NOS活性測定結果如表1所示。與正常對照相比，百草枯處理模型組MDA含量明顯升高、NO含量明顯降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px、CAT及NOS活性明顯降低(均P<0.05)，表明模型組大鼠受到百草枯所致氧化應激損傷，造模成功。與百草枯處理模型組相比，金櫻子中高劑量組的所有指標及低劑量組的GSH-Px、NO和NOS均有顯著性差異(P<0.05)，其中高劑量組的MDA和CAT與正常對照相比已無顯著性差異(P>0.05)。

MDA作為膜脂質發(fā)生過氧化的主要終產(chǎn)物之一，其含量高低表明細胞受到脅迫嚴重程度；SOD、GSH-Px和CAT活性的高低反映了機體清除氧自由基、抗氧化的能力，其水平的高低反映了機體受自由基攻擊程度；血管里NO由內皮細胞產(chǎn)生，起到舒張血管的作用，而NOS是催化內源性NO生成的關鍵酶。從表1中可看出，百草枯氧化損傷的大鼠，通過ig金櫻子總黃酮，血清中MDA含量降低，NO含量升高，SOD、GSH-Px、CAT、及NOS活性增加，并呈一定的量效關系，表明金櫻子總黃酮對氧化應激引起損傷的大鼠有一定的保護作用。

表1 金櫻子總黃酮對氧化應激引起的大鼠血清MDA、SOD、GSH-Px、CAT、NO及NOS水平的影響

注：*與正常對照組比較：P<0.05；**與百草枯模型對比：P<0.05

2.2 大鼠腹主動脈病理學觀察結果

血管的病理形態(tài)學比較結果見圖1。光鏡觀察血管病理形態(tài)學改變：染色后鏡下觀察可見正常對照組血管平滑肌排列整齊，內膜光滑；百草枯模型對照組動脈內壁有多層大量泡沫細胞形成，脂質浸潤，內皮細胞中有氣球樣變性，部分細胞脫落，平滑肌細胞排列紊亂；金櫻子總黃酮干預各組相對模型對照組病理變化有所減輕，其中高劑量組血管平滑肌排列稍有紊亂，但內膜較光滑，組織炎癥細胞浸潤不明顯。由此可見，金櫻子總黃酮能降低氧化應激引起的大鼠動脈內皮損傷程度。

(a) 正常對照組；(b) 模型對照組；(c) 黃酮干預低劑量組；(d) 黃酮干預中劑量組；(e) 黃酮干預高劑量組圖1 各組大鼠血管的形態(tài)學比較(×400)

2.3 各組大鼠主動脈離體血管環(huán)張力測定結果

各組動脈對ACh舒張作用的反應如圖2所示。當KCL引起大鼠腹主動脈環(huán)的收縮達最大幅度后，各組最大舒張率對ACh有一定的濃度依賴性。不同劑量金櫻子總黃酮均對干預的氧化應激損傷模型組內皮完整的血管環(huán)具有舒張作用，最大舒張率分別為(49.66±0.52)%、(61.29±0.51)%及(74.73±0.81)%(P<0.05)，均高于模型對照組最大舒張率(45.69±0.42)%，舒張程度與黃酮呈一定的量效正相關，其中最大劑量最大舒張效應與正常組(77.63±0.91)%相比已無顯著性差異(P>0.01)。此結果提示，金櫻子總黃酮對氧化應激引起的大鼠動脈內皮損傷有一定的保護作用，改善血管的舒張功能。

圖2 金櫻子總黃酮對氧化應激損傷大鼠動脈血管舒張功能的影響

3 結論

本研究選用百草枯氧化應激損傷血管模型，探討了金櫻子總黃酮對氧化應激損傷血管內皮的保護作用。百草枯與氧反應產(chǎn)生的超氧陰離子在SOD的催化下產(chǎn)生H2O2，接著在Fe2+的催化下分解為羥自由基，因此百草枯可通過提高大鼠體內ROS水平引起氧化應激反應[20]，引起血管氧化應激損傷。通過ig大鼠金櫻子總黃酮后，與百草枯模型組相比，中高劑量組的大鼠血清中MDA的含量有所降低，而SOD、CAT、GSH-Px和NOS的活性顯著升高，NO水平顯著升高(P<0.05)。病理切片顯示，百草枯提高大鼠體內氧化應激水平后，動脈內皮組織形成泡沫細胞，出現(xiàn)部分脫落等病理變化，而ig黃酮組動脈內皮損傷明顯減輕。大鼠主動脈離體血管環(huán)張力測定結果也表明，黃酮組血管環(huán)對ACh的舒張血管效應較對模型照組明顯增加。以上實驗結果提示，金櫻子總黃酮可能通過降低大鼠體內的氧化應激反應，增加NO的可利用性以保護內皮功能，具有較強的體內抗過氧化能力及氧化損傷的保護功能。

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Abstract: To investigate the effects of tota Michx on vascular oxidative stress injury in experimental rats l flavonoids in Rosa laevigata. The rats were intraperitoneally injected with paraquat to induce oxidative stress injury in experimental form and give low and middle and high (25 mg/kg kg·d-1, 50 mg/kg kg·d-1, 100 mg/kg kg·d-1) doses of total flavonoids of R. laevigata Michx to for up to 12 weeks. Then the effect of total Flavones of R. laevigata Michx on the above biochemical index is observed; at the same time, abdominal aortas of rats in groups are taken to make blood vessel slices compared pathologically and morphologically, and then the isolated aortic rings are measured and analyzed. Results show that medium-and?high-dose of flavonoids could improve the related biochemical indexes of rats (P<0.05), arterial endothelial injury is alleviated significantly, vascular ring relaxation is dramatically enhanced and decrease oxidative stress in rats to protect their endothelium?function.

Keywords: Rosa laevigata Michx； total flavonoids； rats； oxidative stress; vascular endothelial injury