韋傳寶，鄧 輝

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.皖西學(xué)院 抗體制備及其質(zhì)量檢測中心，安徽 六安 237012)

白眉蝮蛇(Agkistrodonhalysussuriensis)分布于我國東北地區(qū)[1]，是我國特有劇毒蛇，與江浙蝮蛇親緣關(guān)系較近，該蛇為血循環(huán)型毒蛇，含類凝血酶和出血毒素[2]。類凝血酶是一種蛋白水解酶，具有抗凝、溶栓、去纖、擴(kuò)張血管和改善微循環(huán)等多種功效[3-5]。由它水解生成的纖維蛋白凝塊，沒有側(cè)鏈交聯(lián)而易被纖溶酶降解，不引起血栓，因此在臨床上可用于防治血栓性疾病。從白眉蝮蛇毒中提取的類凝血酶由中國衛(wèi)生部命名為降纖酶(Defibrase)，已應(yīng)用于臨床。目前對白眉蝮蛇毒研究較多的成分也是“類凝血酶”，但是對出血毒素的研究尚未見報(bào)道。

在研究蛇毒出血毒素時，最基本的問題是要搞清楚所研究的蛇毒中含有多少種出血毒素，本研究通過試用多種蛋白染色試劑盒，找到了一種對蛋白質(zhì)能夠染色又不影響蛋白質(zhì)活性的染色試劑盒，因此能夠快速、方便地鑒定白眉蝮蛇毒中出血毒素的種類在研究蛇毒出血毒素時，最基本的問題是要搞清楚所研究的蛇毒中含有多少種出血毒素，本研究通過試用多種蛋白染色試劑盒，找到了一種對蛋白質(zhì)能夠染色又不影響蛋白質(zhì)活性的染色試劑盒，能夠快速方便地鑒定白眉蝮蛇毒中出血毒素的種類。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

白眉蝮蛇毒購自安徽省祁門縣祁門蛇傷研究所；DEAE-纖維素購自Sigma公司；高靈敏快速考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒(產(chǎn)品編號：C510041)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；小鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)，規(guī)格18～22克；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)、層析柜、酶標(biāo)儀、電泳儀、電泳槽等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 出血毒素的初步分離純化

用DEAE-纖維素離子交換凝膠吸附白眉蝮蛇毒的酸性蛋白，收集、濃縮、透析和保存未被吸附的堿性蛋白。被吸附在DEAE-纖維素凝膠中的白眉蝮蛇毒酸性蛋白分別用含不同濃度NaCl 的Tris-HCl 緩沖液(0.05 M，pH7.4)分段洗脫，NaCl濃度分別為0.05 M、0.10 M、0.15 M、0.2 M和0.5 M。每種濃度NaCl洗脫的組份分別收集、濃縮、透析和保管。

1.2.2 出血活性的檢測

傳統(tǒng)的出血活性檢測是用家兔皮內(nèi)注射的方法，最小出血劑量為產(chǎn)生直徑10 mm出血斑點(diǎn)的出血毒素量[6]。本研究用18～22 g小鼠用于檢測出血活性。小鼠有出血敏感、試驗(yàn)方便、成本低的優(yōu)點(diǎn)。采用1 mL的注射器，將待測樣品總量控制在0.2 mL，如果少于0.2 mL用生理鹽水補(bǔ)齊。將樣品注射到小鼠腹部皮下，每只小鼠腹部注射4個點(diǎn)。1小時后處死小鼠并解剖，出血明顯且出血點(diǎn)直徑10 mm以上確定為有出血活性。對于每一種出血毒素，通過注射不同量的出血毒素確定最小出血劑量(MHD)。

1.2.3 制備電泳膠的配制與制備電泳進(jìn)一步純化出血毒素[7]

制備電泳凝膠與檢測電泳凝膠區(qū)別在于前者濃縮膠里不插梳子，12% PAGE制備電泳凝膠的配制見表1。

表1 12% PAGE制備電泳凝膠配制表

將初步純化的白眉蝮蛇出血毒素(0.1 M 濃度NaCl洗脫組份)配制成20 mg/mL濃度溶液，每個電泳槽加1.0 mL出血毒素溶液，電泳結(jié)束取下凝膠，放塑料盒中待染色。

1.2.4 染色與脫色[7]

電泳后的凝膠用高靈敏快速考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒(產(chǎn)品編號：C510041)染色。該試劑盒由染色液A、染色液B和脫色液組成，染色液A主要成分為考馬斯亮藍(lán)R-250，染色液B含一種特殊物質(zhì)，能夠加強(qiáng)考馬斯亮藍(lán)R-250與凝膠中蛋白質(zhì)的結(jié)合，但考馬斯亮藍(lán)R-250與聚丙烯酰胺凝膠的結(jié)合很弱。染色時按照說明書規(guī)定的比例混合物染色液A和染色液B，為了方便脫色，染色的時間從30分鐘(說明書中要求時間)縮短到5分鐘，染色后用蒸餾水進(jìn)行脫色，中途換2～3次蒸餾水。試劑盒中的脫色液含蛋白質(zhì)變性劑，脫色后出血毒素的出血活性消失，水脫色使出血毒素的出血活性保留。

1.2.5 出血毒素種類的鑒定

經(jīng)過蒸餾水多次脫色后，凝膠上蛋白質(zhì)條帶十分清楚，而且出血毒素蛋白條帶中的出血毒素仍然具有出血活性。對每一個蛋白條帶，用手術(shù)刀切下約2.5厘米長度的凝膠條帶。加0.25 mL的生理鹽水于研缽中將凝膠磨細(xì)，將樣品注射到小鼠(重18～22克)腹部皮下，1小時后處死小鼠并解剖，觀察注射部位是否有出血點(diǎn)，出血點(diǎn)對應(yīng)的蛋白條帶為出血毒素，出血點(diǎn)的數(shù)量即是出血毒素的種類。

2 結(jié)果

2.1 白眉蝮蛇出血毒素初步分離結(jié)果

被吸附在DEAE-纖維素凝膠中的白眉蝮蛇毒酸性蛋白分別用含不同濃度NaCl 的Tris-HCl 緩沖液(0.05 M，pH7.4)分段洗脫，NaCl濃度分別為0.05 M、0.10 M、0.15 M、0.2 M和0.5 M。經(jīng)出血活性測定，濃度為0.10 M NaCL洗脫的組份含出血活性，其他洗脫組份(包括堿性蛋白組份)沒有出血活性，說明白眉蝮蛇出血毒素能夠被含0.1 M NaCl的Tris-HCl緩沖液(pH7.4, 0.05 M)洗脫下來。

2.2 12% PAGE制備電泳結(jié)果

12% PAGE制備電泳進(jìn)一步純化白眉蝮蛇出血毒素的結(jié)果見圖1。0.1 M NaCl的Tris-HCl緩沖液(pH7.4, 0.05 M)洗脫組份在12% PAGE制備電泳凝膠上出現(xiàn)6條比較清楚的蛋白條帶，分離效果很好。

圖1 12% PAGE制備電泳進(jìn)一步純化白眉蝮蛇出血毒素電泳圖

2.3 出血毒素種類鑒定結(jié)果

出血毒素種類鑒定結(jié)果見圖2。蛋白條帶1磨細(xì)后注射到小鼠皮下出現(xiàn)出血點(diǎn)，其他未出現(xiàn)出血點(diǎn)，說明蛋白條帶1是一種出血毒素。

圖2 蛋白條帶1磨細(xì)后注射到小鼠皮下出現(xiàn)的出血點(diǎn)

3 討論

在研究蛇毒出血毒素過程中，知道某種蛇毒含幾種出血毒素是最基本的要求。過去解決這個問題的方法是分別分離各種出血毒素，故需要進(jìn)行大量的分離工作，耗費(fèi)了大量的人力和財(cái)力[8]。本研究的成功很好地解決了這個問題。

本研究的一個關(guān)鍵點(diǎn)是找到了一種蛋白染色試劑盒，是生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)的高靈敏快速考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒(產(chǎn)品編號：C510041)，該試劑盒的染色劑能夠使蛋白質(zhì)著色但不會使蛋白質(zhì)變性，這與大部分蛋白質(zhì)染色劑不同。該試劑盒由染色液A、染色液B和脫色液組成，染色液A主要成分為考馬斯亮藍(lán)R-250，染色液B含一種特殊物質(zhì)，能夠加強(qiáng)考馬斯亮藍(lán)R-250與凝膠中蛋白質(zhì)的結(jié)合，但考馬斯亮藍(lán)R-250與聚丙烯酰胺凝膠的結(jié)合很弱。使用時染色液A和染色液B按照比例混合，染色時考馬斯亮藍(lán)R-250快速與凝膠中的蛋白質(zhì)結(jié)合，幾乎不與聚丙烯酰胺凝膠結(jié)合。為了便于脫色，染色時間降低到了5分鐘。染色后不用試劑盒中的脫色液脫色，因?yàn)槊撋褐泻鞍踪|(zhì)變性劑，脫色后出血毒素的出血活性消失，我們改用蒸餾水脫色，而水脫色使出血毒素的出血活性保留。

本研究的另一個關(guān)鍵點(diǎn)是用12% PAGE制備電泳進(jìn)一步純化白眉蝮蛇出血毒素組份。與離子交換層析和分子篩層析的方法比，電泳方法分離效果更好，且更簡單方便[9,10]。從電泳結(jié)果圖可以看出，12% PAGE制備電泳能夠?qū)⒋值某鲅舅亟M份分離成了6條蛋白質(zhì)條帶，分離效果是離子交換層析和分子篩層析無法達(dá)到的。

從本研究的結(jié)果看，白眉蝮蛇毒含有1種酸性出血毒素，堿性組份中沒有出血毒素，這是前人沒有研究過的，至于出血毒素的性質(zhì)則是本課題組下一步要詳細(xì)研究的內(nèi)容。

參考文獻(xiàn)：

[1]韋傳寶，徐建芬.白眉蝮蛇(Agkistrodonhalysussuriensis)蛇毒精氨酸酯酶對小鼠的生殖毒性及F1子代的影響[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2004，10(5)：623-625.

[2]管立豐，戚正武．蝮蛇蛇毒類凝血酶的研究[J]．生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1982，14(4)：303-313.

[3]RAWLINGS ND, BARRETT AJ. Evolutionary Families of Metallopeptidases[J].Methods Enzymol, 1995, 23(2):248:183-228.

[4]TAKEYA H，ODA K，MIYATA T. The Complete Amino Acid Sequence of the High Molecular Mass Hemorrhagic Protein HRlB Isolated from the Venom of Trimeresurus Flavoviridis[J].J Biol Chem，1990, 18(3):16068-16073.

[5]HITE LA, JIA LJ, BJARNASON JB. cDNA Sequences for Four Snake Venom Metalloproteinases: Structure, Classification, and Their Relationship to Mammalian Reproductive Proteins[J]. Arch Biochem Biophys, 1994, 56(3):308:182-191.

[6]KONDO H, KONDO S, I, kEZAWA H, et al. Studies on the Quantitative Method for Determination of Hemorrhagic Activity of Habu Snake Venom[J]. Japan J med Sci Biol., 1960, 19(4): 43-51.

[7]韋傳寶，曹佳敏.在制備尖吻蝮蛇毒出血素抗血清中不同凝膠染色方法的比較[J].中國免疫學(xué)雜志，2016，32(12)：1793-1796.

[8]WEI CB, CHEN J. LI JH. Acutolysin C, a Weak Hemorrhagic Toxin from the Venom of Agkistrodon Acutus with Leucoagglutination Activity[J]. J Venom Anim Toxins incl Trop Dis., 2011，17(1):34-41.

[9]韋傳寶，李更青，梅元元，等.Studies on the Mutagenesis of α-neurotoxin from Naja Naja Atra Venom[J].中國新藥與臨床雜志，2015，34(10)：764-768.

[10]韋傳寶，汪權(quán)，胡葦，等.尖吻蝮蛇出血毒素Ⅲ分離、抗血清制備、與其它出血毒素血清學(xué)關(guān)系[J].皖西學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，30(2)：95-97.

Abstract: Crude hemorrhagins inAgkistrodonhalysussuriensisvenom were purified through DEAE-cellulose ion exchange chromatography. Acidic proteins inAgkistrodonhalysussuriensisvenom were absorbed by DEAE-cellulose and basic protein flowed out. Basic protein solution was collected, concentrated and dialyzed. Acidic proteins absorbed in DEAE-cellulose were eluted by Tris-HCl buffer (pH7.4) contained 0.05M, 0.1M, 0.15M, 0.2M and 0.5M NaCl step by step. Each component was collected, concentrated, dialyzed and preserved respectively. Hemorrhagic activity for each component was tested and the part with hemorrhagic activity was crude hemorrhagin component. The hemorrhagin in crude hemorrhagin component was purified further through 12% PAGE Preparation electrophoresis. The polyacrylamide gel was dyed using a kit named highly sensitive and rapid Coomassie brilliant blue staining kit (product No. C510041). Dyeing procedures were modified. The gel containing venom proteins was taken out and ground into gel suspension. The gel suspension was injected into mouse abdomen by subcutaneous injection. 1 hour later, the mouse was killed and the numbers of bleeding points was counted. Each bleeding point represents a kind of hemorrhagin. The results indicated that the part eluted by 0.1M NaCl possessed hemorrhagic activity. In this part, there are 2 kinds of hemorrhagins.

Keywords:Agkistrodonhalysussuriensis; hemorrhagin identification; reagent kit