魏婧瑤， 尤 佳， 盧會奇， 宋悅陽， 張 玲

（錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧錦州 121001）

豬鏈球菌作為一種人畜共患病病原菌，其引發(fā)的豬鏈球菌病一直是困擾我國養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一。有報道指出，從帶菌豬體內(nèi)分離出的豬鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和四環(huán)素類等抗生素已產(chǎn)生了高度耐藥性；人體內(nèi)分離出的豬鏈球菌也對諾氟沙星產(chǎn)生了耐藥性 （何彩美，2012)。尋找對該菌既有抗菌作用又不易產(chǎn)生耐藥性的天然中藥，將為防治豬鏈球菌病提供新方案，其結(jié)果勢必具有重大的臨床意義。厚樸酚作為中藥厚樸的有效提取成分（國家藥典委員會，2010)，已證實對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏桿菌、枯草芽孢桿菌等都有較好的抑制作用 （付云賀，2013），并且研究發(fā)現(xiàn)厚樸酚對豬鏈球菌感染的動物模型有治療作用（張玲等，2016）。本研究體外觀察厚樸酚對豬鏈球菌的抑制作用及對其感染巨噬細胞的影響，旨在進一步完善厚樸酚的藥理作用和抗菌機制，為獸醫(yī)臨床挑選防治豬鏈球菌病的獸藥提供理論依據(jù)和試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 SPX-250生化培養(yǎng)箱，購自上海躍進醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1G超凈工作臺，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；Thermo science 3111型CO2細胞培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技實驗室；THZ-300恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科技有限公司；Bio-Rad iMarkTM型酶標檢測儀，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2 主要試劑和菌種 厚樸酚（批號：563421），購自西安開來生物工程有限公司（純度為98%），試驗前，取適量甲醇將其溶解，接著用蒸餾水稀釋至試驗所需濃度，最后在超凈臺下將溶液經(jīng)0.2μm微孔濾膜過濾，備用；MTT，購自美國Sigma公司；腦心浸液培養(yǎng)基，購自中國檢驗檢疫科學研究院北京陸橋技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS），購自Gibco公司；豬鏈球菌2型臨床分離株，從遼寧省錦州市屠宰場的50頭豬病料中分離得到，并由中國獸藥監(jiān)察所鑒定；小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞株，購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2 細菌培養(yǎng) 取臨床分離的豬鏈球菌菌種接種于含血清的腦心浸液固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑單個菌落接種于含血清的腦心浸液液體培養(yǎng)基中，再37℃靜置培養(yǎng)13～14 h，待用。

1.3 豬鏈球菌生長曲線的測定 調(diào)整厚樸酚藥液終濃度為50μmol/L，與豬鏈球菌接觸后，每隔4 h取樣一次，然后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入100μL DMSO，用酶標儀振蕩10 min，在波長為580 nm處測定培養(yǎng)液的OD值，每個取樣點重復3次，取平均值。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制不同組別的豬鏈球菌生長曲線。

1.4 豬鏈球菌細胞膜通透性的測定 調(diào)整厚樸酚藥液終濃度為50μmol/L，與豬鏈球菌接觸后，分別在培養(yǎng) 0、1、2、3、4、5、6、7 h 和 8 h 后取上清液，用電導儀測定其電導率值，以等體積的無水乙醇作對照。每個時間點重復3次，取平均值。

1.5 DNA、RNA等大分子物質(zhì)的測定 按Chen等（2002）所述方法，測定終濃度為 50μmol/L厚樸酚溶液與豬鏈球菌分別接觸 0、1、2、3、4、5、6、7 h和 8 h，取上清液，檢測其中的DNA、RNA等大分子物質(zhì)的吸光值。以不加藥組為對照。重復3次，取平均值。

1.6 巨噬細胞細胞活性的測定 用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整RAW264.7濃度（1.0×106個/mL）接種到6孔板，培養(yǎng)過夜。將菌液濃度按感染復數(shù)（MOI）為 1∶100 的比例加入培養(yǎng)板，以 1000 r/min室溫離心細胞培養(yǎng)板 5 min（Wood，2001），置 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，即為豬鏈球菌組；細胞與細菌混合后分別再加入厚樸酚，調(diào)至終濃度為 25、50、100 μmol/L，即為 25 μmol/L 厚樸酚組、50μmol/L厚樸酚組和100μmol/L厚樸酚組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按1.3中的方法，在波長為570 nm處測定各組光密度OD值，每組重復3次。將對照組的細胞活性設(shè)為100%，其他處理組OD值與對照組相比較計算其細胞活性。細胞活力按照下列公式計算：

1.7 巨噬細胞吞噬細菌數(shù)量的測定 按1.6中的方法將細胞進行分組培養(yǎng)。培養(yǎng)到期后，用PBS洗掉細胞外游離細菌，并添加青霉素至100 U/mL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h殺滅細胞外細菌。棄上清，用細胞刮子刮取細胞，收集細胞懸液并混勻，取1 mL，以2000 r/min離心10 min，去上清，加入1 mL 0.1%Triton X-100 PBS混勻并裂解細胞20 min（Zhou等，2007）。 將混懸液（中菌落數(shù))做 1∶10 的倍比稀釋，取各稀釋度10μL接種到固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。計數(shù)平板菌落數(shù)。

1.8 炎癥因子水平的測定 按1.6中方法分組培養(yǎng)細胞24 h，然后取細胞上清液，待測。所有試劑使用前置于室溫，標準品及樣品至少做三個重復，而且每次分析均做標準曲線。向每個酶標板孔中加入100μL標準品稀釋液或樣品，再各加入50μL抗體稀釋液，封板，振蕩孵育3 h。每孔加入100μL辣根過氧化物酶標記的抗生物素蛋白，封板，室溫孵育30 min。棄液，洗板，每孔依次加入顯色劑底物TMB和終止液。反應(yīng)終止后30 min內(nèi)讀取吸光值，檢測炎癥因子：腫瘤壞死因子（TNF-α）、 白細胞介素-1β （IL-1β）、 白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-8（IL-8）的水平。

2 結(jié)果

2.1 厚樸酚對豬鏈球菌生長曲線的影響 由圖1可知，豬鏈球菌經(jīng)過培養(yǎng)初期的遲緩生長后，快速進入對數(shù)期；而被厚樸酚干預的細菌的生長幅度則較豬鏈球菌組低約68.8%，差異具有顯著性（P＜0.05)，說明厚樸酚可以顯著抑制豬鏈球菌生長，使其不能進入對數(shù)生長期。

2.2 厚樸酚對豬鏈球菌細胞膜通透性的影響由圖 2a可知，厚樸酚作用豬鏈球菌后，培養(yǎng)液的電導率隨時間增加而增大，且除0 h外，厚樸酚組各時間點的電導率較豬鏈球菌組均有4.2%左右的增加，具有統(tǒng)計學差異 （P＜0.05）；在厚樸酚作用后的培養(yǎng)液內(nèi)，大分子物質(zhì)的吸光值并沒有與細菌組有明顯差別，如圖2b所示。上述結(jié)果表明，厚樸酚能夠改變豬鏈球菌細胞膜的通透性，但并不能將其破壞，說明豬鏈球菌細胞膜不是厚樸酚作用的靶點。

圖1 厚樸酚對豬鏈球菌生長曲線的影響

圖2 厚樸酚對豬鏈球菌培養(yǎng)液電導率（a）和大分子物質(zhì)吸光值（b）的影響

2.3 厚樸酚對感染豬鏈球菌巨噬細胞活性的影響 由圖3可知，各組細胞處理24 h后，豬鏈球菌組的細胞活性較空白組降低38.4%（P＜0.01），而三個厚樸酚處理組的細胞活性均較豬鏈球菌組有顯著性改善（P＜0.05），分別提升了9.8%、19.19%和26.8%，且細胞活性的改善與厚樸酚濃度呈正相關(guān)，但與空白組仍存在差異（P ＜ 0.05）。

2.4 厚樸酚對染菌巨噬細胞吞噬細菌數(shù)量的影響 由表1可見，豬鏈球菌與厚樸酚接觸后，三個用藥組的巨噬細胞吞噬細菌數(shù)量較豬鏈球菌組分別有2倍、3倍和5倍量的增加，差異具有顯著性（P＜0.01)，且被吞噬細菌的數(shù)量與厚樸酚的濃度呈正相關(guān)，不同藥物組之間也有明顯差別。

圖3 厚樸酚對感染豬鏈球菌巨噬細胞活性的影響

表1 厚樸酚對染菌巨噬細胞吞噬細菌數(shù)量的影響（n=6)

2.5 厚樸酚對巨噬細胞炎癥因子水平的影響如表2所示，豬鏈球菌組TNF、IL-1β、IL-6和IL-8的水平分別較空白組提高4.6倍、19.7倍、40.31倍和2.85倍（P＜0.01）；使用不同劑量厚樸酚干預后，炎癥因子水平均較豬鏈球菌組有統(tǒng)計學意義上的下降（P＜0.01），其中最大劑量100μmol/L厚樸酚組的四個炎癥因子水平較豬鏈球菌組分別降低了65.5%、72.8%、69.5%和65.1%，但與空白組間仍有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；炎癥因子水平隨著藥物濃度的增加而下降。

表2 厚樸酚對巨噬細胞炎癥因子水平的影響 （n=3） pg/mL

3 討論

本試驗研究厚樸酚對豬鏈球菌的作用，發(fā)現(xiàn)該藥可通過改變細菌細胞膜的通透性發(fā)揮抑菌作用，但對細胞膜并沒有達到破壞效果，說明豬鏈球菌細胞膜并不是厚樸酚作用的靶點。本次研究還發(fā)現(xiàn)，厚樸酚可顯著改善被豬鏈球菌感染的巨噬細胞活性，可有效提高巨噬細胞對細菌的吞噬數(shù)量（P＜0.01)，且這些改善效果都與藥物濃度呈正相關(guān)。說明厚樸酚對豬鏈球菌感染的療效與改善巨噬細胞活性和吞噬力有關(guān)。

細胞因子是固有免疫應(yīng)答階段產(chǎn)生的免疫效應(yīng)分子，根據(jù)細胞因子的作用特點將其劃分為促炎細胞因子和抗炎細胞因子。TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-8等促炎細胞因子可增強機體或細胞的炎癥反應(yīng)，其濃度變化是考察炎癥發(fā)生程度和藥物治療效果的一個重要指標。受細菌或者病毒刺激的組織或細胞也通過釋放促炎細胞因子誘發(fā)炎癥（Tosi等，2005）。而抗炎介質(zhì)，如抗炎藥物及抗炎細胞因子等，在炎癥發(fā)生時可通過下調(diào)促炎因子的水平，降低炎癥反應(yīng)（仲偉婷等，2012）。本次研究發(fā)現(xiàn)厚樸酚可有效下調(diào)被豬鏈球菌感染的巨噬細胞釋放促炎細胞因子水平，與仲偉婷等（2012）的厚樸酚可下調(diào)LPS誘導細胞因子釋放的結(jié)果相一致。關(guān)于厚樸酚抑制豬鏈球菌感染的相關(guān)作用位點和信號通路還有待進一步研究。

參考文獻

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