馮 富，曲業(yè)鵬，馬有智

(浙江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

生物被膜是一種附著于生物或非生物表面，包裹著由其自身產(chǎn)生的細(xì)胞外多聚基質(zhì)、具有三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞群體[1]，是細(xì)菌生長過程中為適應(yīng)生存環(huán)境而在固體表面上生長的一種與游離菌相對應(yīng)的存在形式[2]。據(jù)報道，細(xì)菌形成生物被膜存在免受外界傷害、營養(yǎng)條件豐富、細(xì)菌與細(xì)菌間形成共同體以及細(xì)菌自我編碼的生存方式等多種誘因[3]。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，AH)在自然界中廣泛分布，對水產(chǎn)動物、畜禽和人類均有致病性，可引起多種水產(chǎn)動物的敗血癥和人類腹瀉，往往給淡水養(yǎng)殖業(yè)造成慘重的經(jīng)濟損失。近年來嗜水氣單胞菌生物被膜引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，已有研究將嗜水氣單胞菌生物被膜作為口服疫苗[4]，而生物被膜形成影響因素方面鮮有報道。本研究采用生物被膜體外定量檢測方法，探討了時間、溫度、Ca2+、Mg2+、葡萄糖以及人纖維蛋白原對嗜水氣單胞菌生物被膜形成的影響，為制備生物被膜條件優(yōu)化提供了數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌AH-X由浙江大學(xué)水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖實驗室提供；TSA培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；LB培養(yǎng)基按常規(guī)使用方法配制；人纖維蛋白原購自上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.2 生物被膜的形成與測定

生物被膜制備與定量檢測參考Stepanovic等[4-5]的96孔板法并加以改進，具體步驟如下：菌懸液與培養(yǎng)基按1∶100體積混合均勻后取200 μL加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板小孔中，25 ℃(或37 ℃)靜置培養(yǎng)后棄去培養(yǎng)液，用生理鹽水250 μL清洗3次以去除游離菌，55 ℃烘箱干燥后往各孔加入200 μL甲醇，固定15 min，室溫干燥；往各孔加入200 μL 0.1%結(jié)晶紫溶液，室溫染色30 min后棄去染色液，0.85%生理鹽水250 μL清洗3～5次；55 ℃干燥后各孔加入33%乙酸200 μL，待完全溶解后用酶標(biāo)儀測定D570值。

1.3 培養(yǎng)時間對生物被膜形成的影響

將培養(yǎng)時間設(shè)置為2、8、12、20、24、36、48 h，按1.2方法測定不同培養(yǎng)時間生物被膜的D570值。

1.4 培養(yǎng)溫度對生物被膜形成的影響

將培養(yǎng)溫度設(shè)置為25、37 ℃，按1.2節(jié)方法測定各培養(yǎng)溫度所形成的生物被膜的D570值。

1.5 葡萄糖對生物被膜形成的影響

添加2%、3%、4%、5%、6%、8%、10%和20%不同濃度梯度的葡萄糖于LB培養(yǎng)基中作為能量來源，用優(yōu)化后的最佳條件25 ℃培養(yǎng)AH-X，按1.2節(jié)方法測定各培養(yǎng)溫度所形成的生物被膜的D570值。

1.6 Ca2+、Mg2+對生物被膜形成的影響

分別向LB培養(yǎng)基中添加CaC12、MgC12至終濃度為0.1、1.0和10.0 mmoL·L-1，按1.2節(jié)方法測定添加CaC12和MgC12所形成的生物被膜的D570值。以不添加CaC12、MgC12的LB培養(yǎng)基為陰性對照。

1.7 人纖維蛋白原對生物被膜形成的影響

分別向LB培養(yǎng)基中添加人纖維蛋白原至終濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、5.0 mg·mL-1，按1.2節(jié)方法測定各濃度的生物被膜形成量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用Excel、Graphpad prism 5軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時間對生物被膜形成的影響

采用LB培養(yǎng)基，在不同的培養(yǎng)時間對生物被膜進行測定。如圖1所示，培養(yǎng)2 h后生物被膜已經(jīng)開始形成，在12 h時生物被膜D570達到峰值。

圖1 培養(yǎng)時間對生物被膜形成量的影響

2.2 培養(yǎng)溫度對生物被膜形成的影響

如圖2所示，將嗜水氣單胞菌分別置于25 ℃與37 ℃培養(yǎng)，分別取3個時間點16、24和48 h進行測定，25 ℃條件培養(yǎng)下形成生物被膜的D570值均高于37 ℃，經(jīng)統(tǒng)計分析均為差異極顯著。

圖2 培養(yǎng)溫度對生物被膜形成量的影響

2.3 葡萄糖對生物被膜形成的影響

如圖3所示，在葡萄糖濃度從0到2%時嗜水氣單胞菌生物被膜形成的D570值極顯著增加，當(dāng)濃度大于3%時，AH生物被膜的D570值隨葡萄糖濃度增加而下降，大于6%后趨于平穩(wěn)。

圖3 葡萄糖對生物被膜形成量的影響

2.4 Ca2+、Mg2+ 對生物被膜形成的影響

如圖4所示，隨著Ca2+濃度的增加，生物被膜形成量呈現(xiàn)上升趨勢。當(dāng)氯化鈣濃度到達10.0 mmoL·L-1時，嗜水氣單胞菌生物被膜形成量顯著高于對照組和0.1、1.0 mmoL·L-1添加組。如圖5所示，添加氯化鎂各組之間形成生物被膜量沒有顯著差異。

圖4 Ca2+對生物被膜形成量的影響

圖5 Mg2+ 對生物被膜形成量的影響

2.5 人纖維蛋白原對生物被膜形成的影響

如圖6所示，添加不同濃度纖維蛋白原各組生物被膜形成的D570與不添加纖維蛋白原的組差異極顯著，添加不同濃度纖維蛋白原的各組間無顯著差異。

圖6 人纖維蛋白原對生物被膜形成量的影響

3 討論

Abdallah等[6]研究發(fā)現(xiàn)溫度對生物被膜的形成影響極顯著，F(xiàn)uchs等[7]發(fā)現(xiàn)溫度同時影響生物被膜形成量和結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果顯示25 ℃條件下生物被膜的形成量顯著高于37 ℃，與其結(jié)果一致，由此推測嗜水氣單胞菌生物被膜形成的最適溫度可能在25～30 ℃。

一定濃度葡萄糖有利于嗜水氣單胞菌生物被膜的形成，生物被膜形成量顯著上升，其原因可能是一定濃度葡萄糖可以促進嗜水氣單胞菌的生長，并且可以增加細(xì)菌間的黏合度，更利于形成生物被膜或已形成的生物被膜不易被分解[8-9]。當(dāng)葡萄糖濃度大于3%時反而對生物被膜的形成有抑制作用，其可能原因是葡萄糖濃度過高，造成滲透壓過高，對細(xì)菌的增殖有抑制作用，因此生物被膜的形成量會在一定程度上減少。據(jù)文獻報道，在低營養(yǎng)的M63培養(yǎng)基中添加葡萄糖以后有利于生物被膜的形成[10]，與以上研究結(jié)果一致。

Kannan等[11]研究結(jié)果顯示鈣離子促進胞外多糖形成以及提高黏附力的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于鎂離子，從而更有利于生物被膜的形成與穩(wěn)固。殷文政等[12]研究了4種金屬陽離子(Mg2+、Ba2+、Ca2+、Fe2+)對乳源性金黃色葡萄球菌生物被膜生長的影響，結(jié)果顯示，Mg2+離子和有限濃度的Fe2+離子可以促進乳源性金黃色葡萄球菌生物被膜的生長。本試驗結(jié)果表明鈣離子能促進嗜水氣單胞菌生物被膜的形成，而提高鎂離子濃度生物被膜的形成沒有顯著變化。鎂離子對生物被膜形成影響的差異性，推測是由于細(xì)菌種類的不同而產(chǎn)生的。

本試驗發(fā)現(xiàn)人纖維蛋白原對嗜水氣單胞菌生物被膜的形成有抑制作用，而對鏈球菌[13-14]、腸球菌[15-16]的生物被膜形成有促進作用。研究顯示纖維蛋白原對生物被膜形成的作用并不是對細(xì)菌增殖的影響[14]，而是有其他機制的存在。纖維蛋白原與細(xì)菌[17-18]及其表面吸附蛋白結(jié)合[19]，從而增強其吸附力，提高了生物被膜的形成能力。鏈球菌能合成纖維蛋白原表面結(jié)合蛋白[17]，為二者黏附的橋梁，推測嗜水氣單胞菌表面可能缺少這種蛋白，故纖維蛋白原不能促進其生物被膜的形成，至于抑制作用的原因還有待進一步的研究。

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