胡靄臻，鄭善堅(jiān)*，林威丞，金米雪，謝夢佳，包伊鵬，李 柯

(浙江師范大學(xué) a生化學(xué)院，b野生動物生物技術(shù)與保護(hù)利用浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 金華 321004)

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)，又名石蛙，是我國棘蛙屬中分布最廣的物種之一。棘胸蛙主要分布于云南、貴州、安徽、江蘇、浙江、江西、湖北、湖南、福建、廣東、廣西和香港等地[1]。20世紀(jì)80年代以后，我國棘胸蛙產(chǎn)業(yè)已初具規(guī)模，并且呈現(xiàn)快速發(fā)展的趨勢[2]。

蛙病毒屬病毒宿主廣泛，可以感染爬行類、魚類和兩棲類，大部分病毒對宿主都有較強(qiáng)的致病性和致死性[3-4]。2016年本實(shí)驗(yàn)室從浙江麗水某養(yǎng)殖場的棘胸蛙上分離到虹彩病毒科、蛙病毒屬病毒，暫命名為棘胸蛙虹彩病毒(QSIV)。感染該病毒的蛙腹部發(fā)紅，頭部、四肢皮膚潰爛，死亡率高達(dá)90%以上。免疫防治被認(rèn)為是目前防治蛙等水生動物病毒性疾病的最有效、最安全和最有潛力的方法之一[5]，本文就棘胸蛙虹彩病毒的疫苗制備及免疫方法進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

棘胸蛙虹彩病毒(QSIV)為本實(shí)驗(yàn)室提供；實(shí)驗(yàn)用棘胸蛙來自綠谷清泉石蛙養(yǎng)殖合作社，平均規(guī)格(52±3.5)g；病毒DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；EPC細(xì)胞由浙江省淡水水產(chǎn)研究所惠贈；ELISA試劑盒、M119培養(yǎng)基(Gbico，11150059)、胎牛血清(BI，0010316)、β-丙內(nèi)酯(索萊寶公司，20170711)、二乙烯亞胺(Sigma，8044)購自江蘇凱基生物公司。

1.2 病毒培養(yǎng)

選擇生長良好的EPC細(xì)胞接種棘胸蛙虹彩病毒，23 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞脫落75%以上時收集病毒，-20 ℃中保存[6]。將所有制得的病毒液混合，按Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度[7]。將病毒液稀釋至1×108TCID50·mL-1，作為制備疫苗的原材料。

1.3 疫苗滅活條件的篩選

1.3.1 疫苗的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[8]，將收集的病毒稀釋液分別用終濃度為0.025%、0.050%、0.100%、0.200%的β-丙內(nèi)酯(BPL)、福爾馬林，終濃度為0.5%、1.0%、2.0%和3.0%二乙烯亞胺(BEI)滅活劑滅活。BPL滅活溫度為4 ℃，福爾馬林、BEI滅活溫度為37 ℃；滅活時間分別為24、48、72、96 h。將制得疫苗暫存在4 ℃冰箱中。

1.3.2 疫苗的安全性檢驗(yàn)

將所制得的疫苗分別接種于EPC細(xì)胞，設(shè)置2個重復(fù)；同時，設(shè)置接種棘胸蛙虹彩病毒的陽性對照組和滅菌純水的空白對照組。將未出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)的細(xì)胞凍融3次后，在EPC細(xì)胞上盲傳3代，每代培養(yǎng)7 d，逐日觀察細(xì)胞病變情況[9]。

1.3.3 疫苗的無菌檢驗(yàn)

將所制得的疫苗分別接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)3 d，觀察培養(yǎng)基中有無細(xì)菌生長。

1.3.4 疫苗的PCR檢測

根據(jù)病毒DNA提取試劑盒提取疫苗和病毒核酸，以蒸餾水為空白對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 40 s；退火52 ℃ 40 s、延伸72 ℃ 40 s，30個循環(huán)；再延伸72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果[10-11]。

1.4 免疫途徑

將棘胸蛙隨機(jī)均分為6組，每組20只。3組為注射組，A、B組分別肌肉注射0.2 mL 1×107TCID50·mL-1、1×108TCID50·mL-1的疫苗，C組注射等劑量的PBS。3組為噴霧組，D、E組分別用噴壺將0.2 mL 1×107TCID50·mL-1疫苗噴至霧蛙皮膚，D組噴霧1次，E組每隔10 min噴霧1次，共噴霧5次，F(xiàn)組噴純水；噴霧結(jié)束10 min后放回養(yǎng)殖池。免疫后每隔7 d心臟采血1次，至第28 d共采血4次。將血樣室溫靜置1 h，4 ℃冰箱靜置24 h，3 000 r·min-1離心10 min，取上清備用。

1.5 免疫效果評價

1.5.1 血清抗體效價檢測

將疫苗12 000 r·min-1離心15 min，取上清，用包被液稀釋，在96孔酶標(biāo)板各孔中加入稀釋的抗原100 μL，37 ℃溫箱孵育，2 h后取出甩干各孔包被液，每孔加入封閉液100 μL，37 ℃孵育1 h后甩干封閉液，用洗滌液洗板2次。將待測血清用洗滌液從1∶5倍比稀釋至1∶1 280，每個稀釋度8個重復(fù)，每孔加入100 μL不同稀釋度的血清，并設(shè)置洗滌液為空白對照。37 ℃培養(yǎng)箱溫浴1 h，洗板4次；在酶標(biāo)板各孔加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG 100 μL，37 ℃孵育1 h，洗板5次；

各孔加入TMB顯色液100 μL，室溫避光靜置10 min后加入終止劑終止反應(yīng)。在405 nm波長下，測定光密度值。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：檢測孔D值/陰性孔D值，>2.1為陽性，<1.5為陰性，1.5～2.1為可疑。以出現(xiàn)陽性孔的最高稀釋度作為待檢血清效價[12-13]。

1.5.2 相對免疫保護(hù)率檢測

免疫后35 d，選擇抗體效價較高表噴霧免疫組和注射免疫組進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，同時設(shè)1組未經(jīng)免疫的空白對照組。每組6只棘胸蛙，分別肌肉注射0.2 mL的1×107TCID50·mL-1病毒液。攻毒后每天觀察并記錄感染發(fā)病與死亡情況，連續(xù)觀察21 d，計(jì)算相對免疫保護(hù)率[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒培養(yǎng)情況

不同稀釋度的病毒液接種后4 d，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變現(xiàn)象，單層細(xì)胞呈破網(wǎng)狀(圖1)。共制得300 mL病毒液，混合后，采用Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度，結(jié)果為108.125 TCID50·mL-1。

圖1 病毒培養(yǎng)

2.2 疫苗滅活條件

2.2.1 滅活劑滅活濃度和時間

將不同滅活劑、滅活條件制備的疫苗接種于96孔板中的EPC細(xì)胞，將未出現(xiàn)病變的細(xì)胞盲傳3代。根據(jù)細(xì)胞的病變情況，在每組滅活劑中篩選出最適宜濃度和時間的疫苗，得出使用0.1% β-丙內(nèi)酯4 ℃滅活72 h、0.2%福爾馬林37 ℃滅活72 h、1%二乙烯亞胺37 ℃滅活48 h的疫苗符合上述滅活要求(表1)。

表1 疫苗制備條件篩選

注：+++表示未傳代即檢測到病毒，++為第1次盲傳后檢測到病毒，+為第2次盲傳后檢測到病毒，-為3次盲傳均未檢測出病毒。

2.2.2 疫苗安全性

將疫苗接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)3 d后，觀察到培養(yǎng)基上無細(xì)菌生長，表明疫苗沒有細(xì)菌污染。將3組最適滅活條件下制備的疫苗，PCR擴(kuò)增后未檢測出虹彩病毒核酸靶基因(圖2)，說明0.1% β-丙內(nèi)酯4 ℃滅活72 h、0.2%福爾馬林37 ℃滅活72 h、1%二乙烯亞胺37 ℃滅活48 h能夠徹底滅活病毒，且安全性較好?？紤]4 ℃條件下滅活對抗原破壞性小，確定以0.1%丙內(nèi)酯4 ℃滅活72 h制備的疫苗進(jìn)行免疫。

M為DNA marker；1為病毒對照；2為陰性對照(水)；3為β-丙內(nèi)酯滅活組；4為福爾馬林滅活組；5為二乙烯亞胺滅活組圖2 蛙虹彩病毒滅活處理后的PCR鑒定結(jié)果

2.3 免疫途徑

2.3.1 血清中和抗體效價

用不同方法對棘胸蛙接種疫苗后，其血清中和抗體效價相比對照組有顯著升高(表2)。注射免疫組在21 d時達(dá)到最高的抗體效價，其中注射0.2 mL 1×108TCID50·mL-1疫苗組血清中和抗體效價達(dá)到最高的380.2。噴霧免疫組出現(xiàn)最高抗體效價時間晚于注射免疫組，其中噴霧1次0.2 mL 1×107TCID50·mL-1組棘胸蛙血清中抗體效價在28 d時最高，為160。結(jié)果表明，注射免疫和噴霧免疫都能在一定時間內(nèi)產(chǎn)生較高的抗體效價，噴霧免疫需要更長的時間才能發(fā)揮較好的免疫作用。

表2 注射免疫組血清抗體效價

2.3.2 相對免疫保護(hù)力

對照組在病毒攻毒感染后的第8 d出現(xiàn)發(fā)病癥狀，第11 d開始死亡，21 d時共死亡5只，死亡率為83.3%。注射免疫和噴霧免疫組在攻毒后第13 d有死亡，第14 d以后皆無發(fā)病死亡情況(表3)。根據(jù)公式計(jì)算，注射0.2 mL 1×108TCID50·mL-1疫苗組的相對免疫保護(hù)率為80%，噴霧5次組的相對免疫保護(hù)率為60%。

表3 不同免疫組棘胸蛙死亡情況 只

3 小結(jié)和討論

病毒滅活是制備疫苗的關(guān)鍵步驟之一。福爾馬林是一種最常用的滅活劑，主要使病毒核酸變性而達(dá)到滅活病毒的效果。但是福爾馬林對病毒的衣殼蛋白存在破壞作用，易使病原體蛋白的抗原性降低[15]。β-丙內(nèi)酯、二乙烯亞胺對病毒具有很強(qiáng)的滅活作用，能作用于病原體DNA，改變其結(jié)構(gòu)從而達(dá)到滅活目的；其不直接作用于蛋白，不破壞病毒的免疫原性，在維持病毒免疫原性方面優(yōu)于福爾馬林[15-20]?？紤]滅活溫度對抗原的結(jié)構(gòu)會造成破壞，而4 ℃條件對病毒的抗原影響最小，因此確定0.1% β-丙內(nèi)酯4 ℃滅活72 h是棘胸蛙虹彩病毒疫苗制備的最適條件。

血清抗體水平的高低與動物機(jī)體的免疫保護(hù)效果有著密切的關(guān)系[21]。采用注射和噴霧的免疫方法對棘胸蛙進(jìn)行免疫都產(chǎn)生較好的免疫效果。注射0.2 mL 1×108TCID50·mL-1疫苗免疫組在21 d時達(dá)到最高的血清中和抗體效價380.2，噴霧1×107TCID50·mL-1疫苗5次免疫組在28 d時出現(xiàn)較高的血清中和抗體效價360，噴霧免疫相比注射免疫發(fā)揮免疫保護(hù)作用相對滯后。相對免疫保護(hù)力檢測表明，注射0.2 mL 1×108TCID50·mL-1疫苗免疫組的相對免疫保護(hù)率達(dá)到80%，間隔10 min噴霧5次1×107TCID50·mL-1疫苗免疫組的相對免疫保護(hù)力為60%。因此，注射0.2 mL 1×108TCID50·mL-1棘胸蛙虹彩病毒疫苗后，免疫保護(hù)效果最佳。噴霧疫苗時，隨著噴霧次數(shù)增加，免疫效果進(jìn)一步增強(qiáng)，雖然效果上仍不如注射免疫，但是其操作簡便、快速、無損傷，可作為大規(guī)模棘胸蛙虹彩病毒疫苗免疫的有效途徑。

魚類的注射免疫和浸泡免疫已有較多應(yīng)用[22]。棘胸蛙屬于兩棲動物，在免疫系統(tǒng)的發(fā)育上要比魚類高等。兩棲類動物的蛙類可以離開水體進(jìn)行長時間的陸地上生活，其體表皮膚還富含粘液腺和淋巴間隙，兼有皮膚輔助呼吸功能。因此，對蛙類采取體表噴霧免疫，可以通過皮膚進(jìn)行疫苗吸收，刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)免疫作用。研究結(jié)果表明，采用注射免疫或噴霧免疫都能對棘胸蛙虹彩病毒產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)效果，為今后蛙病疫苗的開發(fā)研究與應(yīng)用提供良好前景。

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