謝 琦，湯間儀,馬偉瓊,張寶林，雷正賢,陳惠嫻，吳敏儀,張鼎旋

(1.廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院 廣州市南沙中心醫(yī)院醫(yī)學影像科，廣東 廣州 510180；2.廣州市中西醫(yī)結合醫(yī)院放射科，廣東 廣州 510800；3.惠州中心人民醫(yī)院放射科，廣東 惠州 516001；4.桂林理工大學材料科學與工程學院，廣西 桂林 541000)

干細胞移植后， 可用MR活體示蹤成像監(jiān)測干細胞在宿主體內(nèi)的存活、遷移以及與宿主組織的整合情況[1-2]。前期研究[3-5]發(fā)現(xiàn)經(jīng)改良多醇法加入聚乙二醇/聚乙烯亞胺(polyethylene glycol/polyehthyleneimine， PEG/PEI)修飾，合成表面為正電荷的氧化鐵納米粒子(polyehthyleneimine modified superparamagnetic iron oxide, PEG/PEI-SPIO)具有更高的穩(wěn)定性、溶解性和強磁性，且可在細胞水平不需轉染劑而直接高效率標記脂肪源性干細胞(adipose derived stem cells, ADSCs)。本研究觀察MRI活體示蹤SD大鼠慢性腦缺血模型顱內(nèi)移植經(jīng)PEG/PEI-SPIO標記的ADSCs 的效果。

1 材料與方法

1.1 模型制作 30只SPF級雌性SD大鼠(購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心)，7～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，按文獻[6-7]方法永久性結扎雙側頸總動脈6個月，制成大鼠慢性腦缺血模型。術后將大鼠分籠飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，確保適宜的溫度、濕度，飼養(yǎng)6個月。本實驗獲廣州醫(yī)學院動物實驗倫理委員會批準。

1.2 ADSCs移植

1.2.1 ADSCs的提取、純化、鑒定與PEG/PEI-SPIO的標記 提取4周齡以內(nèi)SD大鼠腹股溝處脂肪組織，經(jīng)消化、離心、純化至P3代細胞進行細胞表面抗原鑒定；將P3代ADSCs加入PEG/PEI-SPIO共孵育培養(yǎng)進行標記，采用細胞計數(shù)板計算并調(diào)整標記細胞密度至105/3 μl懸液，置于無菌EP管，37℃水浴保溫，用于移植實驗[3-4]。

1.2.2 標記后ADSCs的移植 將大鼠模型分為PEG/PEI-SPIO標記細胞移植組和未標記細胞移植組，每組15只。采用10%水合氯醛(350 mg/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉大鼠，將其保定于腦立體定位儀，選取右側側腦室為移植區(qū)，坐標為前囟后0.8 mm，前囟旁1.5 mm，深度5.5 mm[7]，注入標記或未標記ADSCs懸液105/3 μl。術中大鼠體溫維持在36.5℃。

1.3 MR成像 于移植術后第7天、14天、21天，每組各取5只模型鼠行顱腦MR成像。采用Siemens Vrio Tim 3.0T MR掃描儀，7 cm腕關節(jié)線圈，參照文獻[7]定位、麻醉，行以下序列掃描：T1W，TR 600 ms，TE 12 ms，F(xiàn)OV 70 mm×60 mm，矩陣256×233，層厚3.0 mm；T2W，TR 3 700 ms，TE 109 ms，F(xiàn)OV 70 mm×60 mm，矩陣256×256，層厚3.0 mm；T2*W，TR 520 ms，TE 20 ms，F(xiàn)OV 70 mm×60 mm，矩陣256×206，層厚3 mm；T2-mapping，TR 1 100 ms，TE 16、32、48、64 ms，F(xiàn)OV 70 mm×70 mm，矩陣256×206，層厚3.0 mm；SWI：TR 120 ms，TE 45 ms，F(xiàn)OV 80 mm×40 mm，矩陣256×243，層厚0.7 mm。

1.4 病理學檢查 MR掃描結束后，即對移植后的模型鼠進行心臟灌流固定，取鼠腦，于4%多聚甲醛中固定24 h，參照文獻[7]切片，取材從視交叉紋狀體層面到海馬層面、小腦層面，脫水后經(jīng)石蠟包埋，分兩部分用于常規(guī)HE染色及普魯士藍染色。

1.5 數(shù)據(jù)采集

1.5.1 測量T2值 在T2-mapping圖像上，于顳頂葉皮質(zhì)、海馬、小腦選取大小、位置盡量相近的ROI，測量各ROI的T2值，見圖1、2。

圖1 參考大鼠腦立體定位圖譜，距離基線(聽耳線)的位置為6 mm，選取ROI 1、2代表顳頂葉皮質(zhì)，3、4代表海馬 圖2 參考大鼠腦立體定位圖譜，位于基線(聽耳線)的位置，選取ROI 1、2代表小腦

1.5.2 普魯士藍染色 參照T2-mapping圖像測量T2值的ROI相應層面，取大鼠相應部位切片4張，于高倍鏡下(×400)左、右兩側顳頂葉皮質(zhì)、海馬、小腦分別隨機選取5個視野進行測量，使每個區(qū)域5個視野應盡可能大小、位置相同，觀察藍染顆粒數(shù)量。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件。所有計量資料均以±s表示，符合正態(tài)分布且方差齊；采用獨立樣本t檢驗比較2組同一腦區(qū)、同一時間點的T2值、藍染顆粒數(shù)量；采用配對樣本t檢驗比較同一時間點左右兩側腦區(qū)的T2值、藍染顆粒數(shù)量；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MR表現(xiàn) 于T2WI、T2*WI、SWI可見2組顳頂葉皮質(zhì)、海馬散在類圓形低信號區(qū)，以T2*WI顯示最佳；SWI對比度雖好，但難以排除血管影響(圖3、4)。小腦均未發(fā)現(xiàn)明顯異常低信號區(qū)。

2.2 T2值 移植后第7天，2組各腦區(qū)T2值差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；第14天，標記細胞移植組右側顳頂葉皮質(zhì)、右側海馬T2值較未標記細胞移植組縮短(t=4.795、2.998，P=0.013、0.045)，其余各腦區(qū)2組間T2值差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；第21天，標記細胞移植組右側顳頂葉皮質(zhì)T2值較未標記細胞移植組縮短(t=3.958，P=0.007)，其余各腦區(qū)2組間T2值差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；見表1。

2.3 普魯士藍染色 2組大腦顳頂葉皮質(zhì)、海馬均可見散在藍染顆粒，小腦組織內(nèi)未見明確藍色顆粒。標記細胞移植組和未標記細胞移植組移植后各時間點各腦區(qū)藍染顆粒數(shù)量見表2，標記細胞移植組移植后各時間點各腦區(qū)藍染顆粒數(shù)量均較未標記細胞移植組相應時間點腦區(qū)數(shù)量多；2組移植后第14天右側顳頂葉皮質(zhì)、右側海馬及第21天右側顳頂葉皮質(zhì)藍染顆粒數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義(t=2.283、1.841、2.062，P=0.029、0.043、0.032)。

圖3 未標記細胞移植組MRI T1WI(A)、T2WI(B)、T2*WI(C)、SWI(D)于顳頂葉皮質(zhì)及海馬區(qū)可見散在類圓形低信號區(qū)(箭) 圖4 標記細胞移植組MRI T1WI(A)、T2WI(B)、T2*WI(C)、SWI(D)于顳頂葉皮質(zhì)、海馬區(qū)均見散在類圓形低信號區(qū)(箭)

組別移植后第7天右側顳頂葉皮質(zhì)右側海馬右側小腦左側顳頂葉皮質(zhì)左側海馬左側小腦標記細胞移植組64．25±1．0866．90±1．5470．52±5．5165．08±2．0967．95±0．7772．73±8．76未標記細胞移植組64．28±2．2365．10±2．3070．80±1．4262．73±2．6164．70±2．6768．70±0．24t值0．0100．6500．0480．7031．1700．459P值0．9920．5400．9630．5080．2860．677組別移植后第14天右側顳頂葉皮質(zhì)右側海馬右側小腦左側顳頂葉皮質(zhì)左側海馬左側小腦標記細胞移植組49．83±0．5055．60±0．3370．83±5．6959．05±1．5364．20±3．2872．53±4．94未標記細胞移植組59．73±2．0162．68±2．3462．78±3．2657．40±1．3364．90±0．4968．83±4．25t值4．7952．9981．2270．8150．2111．730P值0．0130．0450．2770．4470．8400．134組別移植后第21天右側顳頂葉皮質(zhì)右側海馬右側小腦左側顳頂葉皮質(zhì)左側海馬左側小腦標記細胞移植組55．58±1．6264．20±2．3670．88±3．1459．05±1．9265．68±2．2269．05±3．54未標記細胞移植組62．55±0．7065．48±6．0968．60±4．5760．65±0．8369．00±2．8756．50±3．53t值3．9581．7262．2140．7640．9162．109P值0．0070．1350．0690．4740．3950．056

表2 2組干細胞移植后不同時間不同腦區(qū)藍染顆粒數(shù)量比較(個/mm2，±s，n=5)

表2 2組干細胞移植后不同時間不同腦區(qū)藍染顆粒數(shù)量比較(個/mm2，±s，n=5)

組別移植后第7天右側顳頂葉皮質(zhì)左側顳頂葉皮質(zhì)右側海馬左側海馬標記細胞移植組6．40±1．705．80±1．165．20±1．045．60±0．88未標記細胞移植組6．40±0．885．20±1．204．00±0．844．80±1．31t值0．0000．7930．8960．561P值1．0000．3610．3820．618組別移植后第14天右側顳頂葉皮質(zhì)左側顳頂葉皮質(zhì)右側海馬左側海馬標記細胞組16．40±6．5813．00±5．0016．60±4．8313．0±4．99未標記細胞組6．70±1．348．40±1．246．20±1．106．00±1．21t值2．2831．1331．8411．460P值0．0290．1550．0430．059組別移植后第21天右側顳頂葉皮質(zhì)左側顳頂葉皮質(zhì)右側海馬左側海馬標記細胞組18．00±8．3410．10±3．517．60±1．267．10±1．27未標記細胞組8．20±2．157．50±0．975．80±1．416．00±1．92t值2．0620．4670．0980．026P值0．0320．6750．9430．989

3 討論

既往研究[8-11]表明，腦缺血第1周時常規(guī)HE染色組織切片未見大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元受損，第2周時6%～29%大鼠海馬CA1區(qū)可見有神經(jīng)元損傷，第4周時增加至55%，到第8～13周時可增加至67%，提示腦缺血具有選擇性易損腦區(qū)，大腦皮層、丘腦、海馬、紋狀體均為缺血損傷的敏感腦區(qū)，其中以海馬最為敏感。本實驗選擇大鼠海馬、顳頂葉皮質(zhì)和小腦放置ROI，發(fā)現(xiàn)細胞移植后顳頂葉皮質(zhì)、海馬出現(xiàn)低信號，與既往研究[6-7]結果相符；小腦區(qū)未出現(xiàn)異常信號，考慮雙側頸總動脈永久性結扎術致大鼠慢性腦缺血時，雖然大鼠顱內(nèi)血流量顯著下降，但由于小腦由椎基底動脈供血，小腦血流量下降不明顯，不易受損。

研究[12-13]表明，移植入腦內(nèi)SPIO標記的干細胞可定向遷移至腦損傷部位，推測注射入腦室的干細胞多分布于腦脊液，損傷區(qū)域血腦屏障和腦脊液屏障受到破壞，腦脊液流速和循環(huán)較正常區(qū)域明顯增加，故移植入腦室的干細胞可向損傷部位遷徙[14]。本實驗標記細胞移植組在移植后第14天右側顳頂葉皮質(zhì)和海馬及第21天右側顳頂葉皮質(zhì)的T2值較未標記細胞移植組縮短，相應大鼠腦標本普魯士藍染色顯示藍染顆粒計數(shù)亦增多，提示慢性腦缺血可致受損部位鐵含量增加，T2WI、T2*WI表現(xiàn)為低信號，推測PEG/PEI-SPIO標記的ADSCs可向因慢性腦缺血致受損的顳頂葉皮質(zhì)、海馬遷移，表明對于慢性腦缺血大鼠模型，采用臨床型3.0T MR T2值活體示蹤移植PEG/PEI-SPIO標記ADSCs腦內(nèi)遷移和分布是可行的。

本實驗發(fā)現(xiàn)移植后第21天時，2組右側海馬區(qū)T2值差異無統(tǒng)計學意義，而右側顳頂葉皮質(zhì)區(qū)差異有統(tǒng)計學意義，普魯士染色藍染顆粒計數(shù)亦呈相同變化?？紤]原因，可能在于隨細胞增殖分裂，細胞內(nèi)SPIO濃度逐漸稀釋到低于MRI可探測的數(shù)值；而從右側腦室注射入的移植干細胞多隨腦脊液循環(huán)進入顳頂葉皮質(zhì)區(qū)，海馬區(qū)細胞則通過白質(zhì)神經(jīng)束循環(huán)進入，相對較少。此外，移植細胞還可穿透胼胝體進入對側大腦半球，但數(shù)量更少，也難以進行MR示蹤[12]。

本實驗結果顯示，帶正電荷的PEG/PEI-SPIO標記ADSCs移植入慢性腦缺血大鼠模型后，采用臨床型3.0T MR T2值可活體示蹤移植細胞在大鼠腦內(nèi)的遷移和分布，以同側顳頂葉皮質(zhì)區(qū)明顯，可持續(xù)到移植后第21天，而海馬區(qū)及對側大腦半球難以示蹤。本實驗的主要不足：動物模型數(shù)量少，觀察時長有限。活體情況下，PEG/PEI-SPIO顆粒在ADSCs內(nèi)能持續(xù)標記的最長時間，以及ADSCs分化或凋亡后PEG/PEI-SPIO顆粒的代謝情況等有待進一步觀察。

[參考文獻]

[1] Liu XL, Zhang W, Tang SJ. Intracranial transplantation of human adipose-derived stem cells promotes the expression of neurotrophic factors and nerve repair in rats of cerebral ischemia-reperfusion injury. Int J Clin Exp Pathol, 2014,7(1):174-183.

[2] Im W, Ban J, Lim J, et al. Extracts of adipose derived stem cells slows progression in the R6/2 model of Huntington's disease. PLoS One, 2013,8(4):e59438.

[3] 馬偉瓊,謝琦,張鼎旋,等.多元醇法合成SPIO標記大鼠ADSCS的成神經(jīng)誘導潛能及體外MR成像.中國介入影像與治療學,2015,12(11):686-690.

[4] 馬偉瓊,謝琦,張鼎旋,等.新型超順磁性氧化鐵標記SD大鼠脂肪干細胞的有效性及安全性研究.放射學實踐,2016,31(5):386-392.

[5] Yang G, Ma W, Zhang B, et al. The labeling of stem cells by superparamagnetic iron oxide nanoparticles modified with PEG/PVP or PEG/PEI. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2016,62:384-390.

[6] 馬偉瓊,謝琦,陳明旺,等.臨床醫(yī)用1.5T磁共振對AD模型大鼠的顱腦MR成像研究.中國CT和MRI雜志,2014,12(6):1-3.

[7] 徐海俠.兩血管閉塞聯(lián)合高Cu2+喂養(yǎng)法致大鼠癡呆模型的MR成像研究.廣州：廣州醫(yī)學院,2010:1.

[8] Ma Y, Qu Y, Fei Z. Vascular endothelial growth factor in cerebral ischemia. J Neurosci Res, 2011,89(7):969-978.

[9] Farkas E, Institóris A, Domoki F, et al. The effect of pre-and posttreatment with diazoxide on the early phase of chronic cerebral hypoperfusion in the rat. Brain Res, 2006,1087(1):168-174.

[10] Liu J, Jin DZ, Xiao L, et al. Paeoniflorin attenuates chronic cerebral hypoperfusion-induced learning dysfunction and brain damage in rats. Brain Res, 2006,1089(1):162-170.

[11] Lee B, Sur BJ, Kwon S, et al. Acupuncture stimulation alleviates corticosterone-induced impairments of spatial memory and cholinergic neurons in rats. Evid Based Complement Alternat Med, 2012,2012:670536.

[12] Wennersten A, Meier X, Holmin S, et al. Proliferation, migration, and differentiation of human neural stem/progenitor cells after transplantation into a rat model of traumatic brain injury. J Neurosurg, 2004,100(1):88-96.

[13] Guzman R, Uchida N, Bliss TM, et al. Long-term monitoring of transplanted human neural stem cells in developmental and pathological contexts with MRI. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007,104(24):10211-10216.

[14] Johanson CE, Duncan JA, Stopa EG, et al. Enhanced prospects for drug delivery and brain targeting by the choroid plexus-CSF route. Pharm Res, 2005,22(7):1011-1037.