王亞如 李洪軍 許德志 王建文 周桂芝 楊寶琦

大皰性類天皰瘡(Bullous Pemphigoid，BP)是最常見的自身免疫性表皮下大皰病，多見于60歲以上的老年人，其發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)[1,2]。BP180和BP230是BP的兩種抗原，已經(jīng)明確抗BP180抗體具有致病性, NC16a為BP180外功能區(qū)的非膠原區(qū)，是致病性免疫球蛋白IgG自身抗體結(jié)合的主要靶位[3]。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，30%～50%的BP患者伴隨神經(jīng)系統(tǒng)疾病(Neurological Diseases，ND)，包括認(rèn)知障礙、腦卒中、癲癇、帕金森病和多發(fā)性硬化癥等，表明ND與BP之間存在一定關(guān)聯(lián)[4]。雖然少量研究發(fā)現(xiàn)BP確診后會增加ND的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為患有ND會增加BP發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[5]。既往研究表明BP與神經(jīng)退行性疾病之間具有關(guān)聯(lián)性，BP抗原在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有表達(dá)，因此有學(xué)者認(rèn)為BP180和BP230可能為BP和ND的共同抗原[6,7]。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究在ND患者中檢測BP自身抗體，旨在證實(shí)ND與BP發(fā)病之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 本研究獲得山東省皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。收集ND住院患者以及體檢中心體檢者生化檢查后剩余血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。病例入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)過相關(guān)檢查，主治醫(yī)師及以上職稱醫(yī)師確診主要診斷為ND；對照入選標(biāo)準(zhǔn)：健康體檢者，排除ND、免疫相關(guān)性疾病、腫瘤、大皰性皮膚病、濕疹、多形紅斑、瘙癢病以及慢性蕁麻疹等。

1.1.2 主要試劑 歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司(EUROIMMUN，德國)提供的抗BP180NC16a、抗BP230抗體IgG酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測試劑盒；間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence,IIF)抗表皮棘細(xì)胞橋?？贵w/抗表皮基底膜抗體檢測試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 ELISA方法檢測抗BP180NC16a、抗BP230抗體 檢測依照試劑盒說明書進(jìn)行，評判依據(jù)為歐蒙推薦的正常范圍上限(cut-off)20 RU/mL。認(rèn)為濃度值≥20 RU/mL為陽性；濃度值<20 RU/mL為陰性。

1.2.2 IIF方法檢測抗表皮基底膜帶抗體 熒光顯微鏡下觀察，如果抗表皮基底膜抗體陽性，則在表皮基底層與結(jié)締組織間出現(xiàn)細(xì)線性熒光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22軟件分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 病例組和對照組基本情況 共收集泰安市中心醫(yī)院、濟(jì)南市第五人民醫(yī)院、山東大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科和神經(jīng)外科131例住院ND患者血清，其中男78例，女53例，年齡為19～89歲，平均(61.18±13)歲；樣本疾病類型為腦卒中109例(腦梗塞88例，腦出血19例，腦梗塞合并腦出血2例)、腦腫瘤15例、其他ND疾病7例包括癲癇、震顫、腦膿腫等。病程為0～7年，6例為首次發(fā)病，3例患者病程1年以下，1例患者病程3年，2例患者病程4年，3例患者病程分別為5年、6年、7年。收集到131例與之相匹配的正常對照血清，其中男78例，女53例，年齡為26～96歲，平均(58.98±12.82)歲，兩組間年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=1.383，P=0.168)。

2.2 病例組和對照組抗BP180NC16a和抗BP230抗體陽性率比較 131例ND組中抗BP180NC16a抗體陽性15例，陽性率為11.45%；抗BP230抗體陽性7例，陽性率為5.34%?？笲P180NC16a和抗BP230抗體均為陽性者共2例，1例患者為腦梗死，1例患者為腦梗死并發(fā)顱內(nèi)動脈瘤。

131例對照組中抗BP180NC16a抗體陽性4例，陽性率為3.05%；抗BP230抗體陽性3例，陽性率為2.29%。采用Pearson卡方檢驗(yàn)對兩組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間抗BP180NC16a抗體陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.866，P=0.009)，但是兩組間抗BP230抗體陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.66，P=0.20)。見圖1。

2.3 ≥60歲病例組和對照組血清抗BP180NC16a、抗BP230抗體的陽性率比較 病例組和對照組中≥60歲者中，抗BP180NC16a抗體在ND組中陽性9例，對照組中陽性1例，陽性率為12.5%(9/72)、1.39%(1/72)；抗BP230抗體在ND組中陽性6例，對照組中陽性1例，陽性率分別為8.33%(6/72)、1.39%(1/72)。采用Pearson卡方檢驗(yàn)對兩組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間抗BP180NC16a抗體陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.878，P=0.009)，抗BP230抗體陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.403，P=0.12)。見圖2。

2.4 <60歲病例組和對照組血清抗BP180NC16a、抗BP230抗體的陽性率比較 <60歲受試者中，抗BP180NC16a抗體在ND組中陽性6例，對照組中陽性3例，陽性率分別為10.17%(6/59)、5.08%(3/59)，采用連續(xù)性校正卡方檢驗(yàn)，兩組之間陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.481，P=0.49)；抗BP230抗體在ND組中陽性1例，對照組中陽性2例，陽性率分別為1.69%(1/59)、3.39%(2/59)，采用連續(xù)性校正卡方檢驗(yàn)，兩組之間陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0，P=1)。見圖3。

2.5 病例組中≥60歲和<60歲抗BP180NC16a、抗BP230抗體的陽性率比較 把病例組分為≥60歲和<60歲組， ≥60歲組中抗BP180NC16a抗體陽性9例，抗BP230抗體陽性6例，陽性率分別為12.5%(9/72)、8.33%(6/72)；<60歲組中抗BP180NC16a抗體陽性6例，抗BP230抗體陽性1例，陽性率分別為10.17%(6/59)、1.69%(1/59)。將兩組間進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P值分別為0.68、0.20，均>0.05,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 IIF檢測病例組和對照組血清中的抗基底膜帶抗體的情況 ND組和對照組均未在表皮基底層與結(jié)締組織間出現(xiàn)線性熒光，也無表皮細(xì)胞間熒光沉積，抗基底膜帶抗體均為陰性。

圖1 ND組與對照組抗體陽性分布圖

圖2 ≥60歲ND組與≥60歲對照組抗體陽性分布圖

圖3 <60歲ND組與<60歲對照組抗體陽性分布圖

3 討論

BP在中歐與北美以每10萬居民每年新增0.25～4.28例，且每10年內(nèi)以2～4倍的速度在增長，典型的皮損表現(xiàn)為明顯瘙癢及緊張性大皰[8，9]。BP抗原位于表皮-真皮交界處，基底細(xì)胞通過半橋粒固定在基底膜帶上建立表皮與真皮之間的連接。從分子水平看，BP的自身抗原為兩種半橋粒成分：BP180(BPAg2或XVII膠原)和 BP230(BPAg1)，二者均具有生物活性，既表達(dá)于皮膚中，也在腦組織中表達(dá)[6]。有假設(shè)提出BP自身抗原與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，Sepp?nen等人在尸檢樣品檢測中證實(shí)，BP180存在于人類腦神經(jīng)元中，推測神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生退行性變和炎癥后BP180可以觸發(fā)自身免疫啟動，導(dǎo)致ND患者中抗BP抗體產(chǎn)生[7，10]。

BP診斷根據(jù)典型臨床表現(xiàn)、病灶周圍活檢及直接免疫熒光檢查(DIF)示線狀I(lǐng)gG和C3在基底膜帶沉積。3/4的BP患者在IIF檢查中有針對表皮基底膜的循環(huán)IgG自身抗體在基底膜帶沉積[11]。在過去的幾年中， ELISA的高敏感性和特異性試驗(yàn)已用于BP患者抗體的檢測，成為臨床常規(guī)評估的一部分[12]。因此本研究用ELISA及IIF法檢測ND患者血清樣品是否有抗BP180、抗BP230、抗基底膜帶抗體的存在。

BP自身抗原與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的假設(shè)同樣被本研究結(jié)果所支持，抗BP180NC16a抗體在ND患者中的陽性率為11.45%，明顯高于同年齡段的正常人。但是在本研究中，抗BP230抗體在ND患者與正常人中無明顯差異。既往研究發(fā)現(xiàn)抗BP180抗體與臨床BP的發(fā)生相關(guān)性更高，因?yàn)锽P180胞外域NC16a區(qū)域識別IgG是BP的發(fā)病關(guān)鍵和早期改變，隨后是抗BP230抗體的表位擴(kuò)散[13]。本研究數(shù)據(jù)也表明，與ND相關(guān)的自身免疫反應(yīng)抗體是抗BP180NC16a抗體，而不是抗BP230抗體。

多數(shù)研究都表明BP在老年人中具有較高的發(fā)病率[14]，抗BP180抗體在非BP人群中的研究發(fā)現(xiàn)，抗體的發(fā)生率并不因性別或年齡變化而明顯增加[15]。本研究中： ≥60歲ND組和<60歲ND組的抗BP180抗體陽性率分別為12.5%和10.17%，P=0.68；表明ND組不同年齡組間抗體水平無差異。但是抗BP180NC16a抗體在≥60歲的ND組與同年齡對照組中存在明顯差異(p<0.01)，而在<60歲的兩組中，ND組抗BP180抗體陽性率雖高于對照組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異，所以我們認(rèn)為，相對于年齡，ND對抗BP180抗體影響更大，但可能由于樣本量較少或其他混合因素(如合并其他老年性疾病或服用藥物等)，導(dǎo)致其在<60歲的ND兩組中不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。年齡與ND和BP的相關(guān)性仍然需要進(jìn)一步研究。

臨床常使用IIF作為檢測BP抗基底膜帶抗體的方法，其敏感性為75%～96%[17，18]。然而，結(jié)合臨床特點(diǎn)、病理分析和IIF，才能更好的確診BP。本研究中，使用IIF檢測病例組和對照組血清抗基底膜帶抗體，結(jié)果均為陰性。這一結(jié)果同Kokkonen等[19]的研究結(jié)果相同，他們報(bào)道了18例阿爾茲海默癥患者血清中抗BP180抗體陽性但是抗基底膜帶抗體結(jié)果全部為陰性。

本研究結(jié)果表明，ND患者的自身抗體譜與BP患者體內(nèi)的抗體不一致，或許ND代表一個(gè)BP患者發(fā)病前的亞群。這些患者可能先有神經(jīng)免疫反應(yīng)，后來由于其他因素發(fā)展成為皮膚免疫反應(yīng)。在本研究中ND組和對照組共19例檢測者出現(xiàn)陽性ELISA結(jié)果，迄今為止沒有1例有發(fā)展成BP的臨床證據(jù)，將來是否發(fā)展為BP仍需要隨訪。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)抗BP180NC16a抗體在神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者中有較高的陽性率，推測神經(jīng)炎癥或神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展可能導(dǎo)致血腦屏障功能減弱及腦免疫赦免的缺失,使存在于神經(jīng)組織中的BP180及BP230亞型暴露，經(jīng)由“分子間表位擴(kuò)散”，使神經(jīng)和皮膚的抗原之間發(fā)生“免疫交叉”反應(yīng)，形成針對皮膚的抗原亞型，產(chǎn)生皮膚BP癥狀[10]。這可能與ND患者合并BP有關(guān)，也可解釋為何BP患者常出現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)損害之后。

本研究檢測ND患者血清中BP抗體的情況，未區(qū)分ND疾病種類，也未對陽性患者抗體滴度的動態(tài)變化及后續(xù)結(jié)局進(jìn)行監(jiān)測，如有條件，應(yīng)擴(kuò)大各組樣本后進(jìn)行各疾病之間的比較統(tǒng)計(jì)，并對研究人群(特別是陽性樣本)進(jìn)行前瞻性研究和長期隨訪，有助于更好的了解BP發(fā)生發(fā)展過程以及與ND之間的聯(lián)系。

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