于芳蘋 李麗敏 趙迎春 張昆侖 楊永益

作為全身普遍動脈粥樣硬化的標志之一，頸動脈粥樣硬化已被公認為缺血性腦卒中的獨立危險因素。動脈粥樣硬化是環(huán)境與遺傳因素共同作用的結果，家族性研究表明頸動脈內(nèi)膜中層厚度(Intima-media thickness,IMT)受遺傳因素影響。酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[NAD(P)H]氧化酶產(chǎn)生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)誘導的氧化應激反應會損傷血管內(nèi)皮細胞，發(fā)生血管功能障礙，導致動脈粥樣硬化斑塊的形成，與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及急性缺血性腦卒中的發(fā)生和發(fā)展密切相關[1-2]。p22phox亞基作為NAD(P)H氧化酶的重要組成部分在血管細胞活性氧產(chǎn)生過程中起到了關鍵性的作用[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，-A930G基因多態(tài)性對NAD(P)H氧化酶p22phox亞基活性影響較大，是高血壓病、冠心病等心腦血管疾病發(fā)病的危險因素[4-5]。但是，-A930G基因多態(tài)性與頸動脈粥樣硬化的關系研究甚少。本研究運用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)及基因測序技術分析上海地區(qū)漢族人群頸動脈粥樣硬化與NAD(P)H氧化酶p22phox亞基-A930G基因多態(tài)性的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

頸動脈粥樣硬化組：選擇2015年9月-2016年9月在本院神經(jīng)內(nèi)科就診并伴有頸動脈粥樣硬化的患者258例，其中男142例，女116例，年齡35～83歲，平均年齡(67.36±9.36)歲，高血壓病165例，伴有腦出血或腦梗死共176例。

對照組：同期頸動脈IMT<1.0 mm的體檢健康者共286例，男165例，女121例，年齡31～79歲，平均年齡(65.76±8.36)歲，高血壓病95例，有過腦血管意外病史52例，均符合對照組入選標準。

研究對象均選擇上海松江地區(qū)漢族人群，且均知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 頸動脈彩色多普勒超聲檢測

采用荷蘭飛利浦公司HD11型彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率7.5MHz，兩位超聲科主治醫(yī)師操作?；颊呷∑脚P位，頭部偏向檢查對側45°，充分暴露頸部動脈，分別取橫切面和長軸切面，測量指標為①頸總動脈(CCA)內(nèi)徑：于CCA分叉前1.0～2.0 cm處測量；②頸內(nèi)動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)內(nèi)徑：距分叉膨大部(BIF)以遠1.0～2.0 cm處分別測量；③頸動脈內(nèi)中膜厚度(IMT)：血管腔內(nèi)膜界面的前緣至中膜-外膜界面前緣的垂直距離；④管腔狹窄程度：狹窄率=(正常血管管徑-最窄處管徑)/正常血管管徑×100%。

判定標準[6-7]：根據(jù)頸動脈IMT厚度、有無斑塊形成及頸動脈管徑狹窄程度分成6級，即內(nèi)膜正常為CCA、ICA的IMT<1.0 mm，內(nèi)膜可不光滑，但無明顯隆起斑塊形成；Ⅰ級為CCA、ICA的1.0 mm≤IMT≤1.2 mm；Ⅱ級為頸動脈粥樣硬化斑塊形成，但是頸動脈狹窄率<50%；Ⅲ級為斑塊增大，管腔狹窄率50%～70%；Ⅳ級為管腔狹窄率達70%以上，但未閉塞；Ⅴ級為管腔完全閉塞，無彩色血流及多普勒信號。根據(jù)以上頸動脈多普勒超聲表現(xiàn)分組：將受試者頸動脈IMT<1.0 mm者設為內(nèi)膜正常組，即對照組；Ⅰ～V級患者設為頸動脈粥樣硬化，入頸動脈粥樣硬化組。

排除標準：排除心源性腦栓塞、創(chuàng)傷、心肌梗死、肝腎疾病、自身免疫疾病、凝血異常、腫瘤。

1.2.2 PCR-RFLP檢測及PCR擴增產(chǎn)物堿基序列測定

抽取肘靜脈血2 mL，肝素鈉抗凝管抗凝，采用基因提取試劑盒(美國OMEGA公司生產(chǎn))提取DNA，于-80 ℃保存。

PCR擴增引物：上游引物5’-GTGTGGCTGGAATGGTGGCAGGAG-3’，下游引物5’-GAGGGTCCCACCTGAGCCAATGTG-3’。PCR反應體系：采用50 μL反應體系，模板DNA 15 μL，引物2 μL，2×PCR 反應混合物25 μL，雙蒸水8 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，65.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)，72 ℃末次延伸10 min，反應管冷卻至4 ℃。酶切體系：10×Buffer Bse Ⅺ 2 μL，內(nèi)切酶BseⅪ 1 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，最后加雙蒸水至20 μL，65 ℃恒溫孵育12 h，取10 μL酶切產(chǎn)物加6×DNA 標記染料 2 μL。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳45 min，0.1%嗅化乙錠染色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)檢測電泳表現(xiàn)并照相。

對PCR擴增產(chǎn)物進行堿基序列測定，由上?；鶢栴D生物公司完成。

1.2.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計量資料比較采用成組t檢驗；計數(shù)資料比較用χ2檢驗，Hardy-Weinberg平衡用χ2檢驗。危險因素的篩選采用二分類Logistic回歸。基因頻率和基因型頻率的差異用χ2檢驗或有關校正方法。以P<0.05示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 2組基本臨床資料比較

2組在性別、年齡、體重指數(shù)、血糖、吸煙史、飲酒史等一般臨床資料比較無顯著性差異(P>0.05)；頸動脈粥樣硬化組血壓及腦血管病史比例高于對照組(P<0.05)，而高密度脂蛋白(HDL)、載脂蛋白A(ApoA)水平低于對照組(P<0.05)(表1)。

表1 頸動脈粥樣硬化組和對照組基本臨床資料比較

注：1 mmHg=0.133 Kpa

2.2 NAD(P)H氧化酶p22phox亞基-A930G基因PCR-RFLP

基因擴增產(chǎn)物通過限制性內(nèi)切酶BseⅪ酶切后得到純合子(AA)基因型為一條254 bp的片斷； 雜合子(AG)基因型為3條不同長度的片段，分別為254 bp、197 bp和57 bp；純合子(GG)基因型被切切為2條片段，長度分別為57 bp和197 bp(圖1)。

2.3 DNA堿基序列檢測

對PCR產(chǎn)物進行DNA堿基測序，基因測序與酶切相匹配(圖2)。

圖1 NAD(P)H氧化酶p22phox亞基-A930G基因PCR擴增產(chǎn)物電泳 M為Marker;1、3、4為AA基因型(254bp);2為AG基因型(254bp、197bp和57bp);5為GG基因型(197bp和57bp)

2.4 2組-A930G基因型頻率及基因頻率比較

頸動脈粥樣硬化組和對照組基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，本研究群體具有群體代表性。頸動脈粥樣硬化-A930G基因AA、AG、GG型基因型頻率與對照組比較有明顯差異(P<0.05)。頸動脈粥樣硬化組A、G等位基因的基因頻率與對照組比較也有明顯差異(P<0.05)(表2)。

表2 2組-A930G基因型頻率及等位基因頻率分布

注：與對照組比較，*P<0.05

2.5 -A930G基因各基因型之間基本臨床資料比較

AA基因型HDL水平及ApoA水平較GG+AG基因型高(P<0.05)，GG+AG基因型吸煙比例較AA基因型高(P<0.05)，而其它臨床資料無顯著差異(P>0.05)(表3)。

表3 -A930G基因各基因型之間基本臨床資料比較±s)

2.6 二分類logistic回歸分析

吸煙、高血壓病、HDL水平、G等位基因是頸動脈粥樣硬化的獨立危險因素(G等位基因：β=0.498，OR=1.785，P=0.031，95%CI=1.364～7.983)(表4)。

表4 頸動脈粥樣硬化危險因素Logistic回歸分析結果

圖2 NAD(P)H氧化酶p22hox亞基-A930G基因測序 箭頭顯示處即為基因多態(tài)性位點,純合子為多態(tài)性位點處出現(xiàn)單條測序峰,雜合子則出現(xiàn)兩條測序峰;紅色峰為T;綠色峰為A;黑色峰為G;藍色峰為C

3 討 論

NAD(P)H是心血管系統(tǒng)包括超氧陰離子(O2-)在內(nèi)的ROS的主要來源。p22phox作為血管NAD(P)H氧化酶的亞單位，在維持氧化酶活性和合成ROS的過程中起關鍵作用[3]。p22phox由CYBA(cytochrome b245 alpha)基因編碼，-A930G CYBA基因多態(tài)性(rs9932581)位于其啟動子區(qū)，影響著CYBA基因的轉錄活性[8]。G等位基因的表達可引起p22phox亞基轉錄活性增高，產(chǎn)生過多的ROS，進而引起血管平滑肌細胞增殖、血管內(nèi)皮功能障礙、脂質(zhì)過氧化、加速動脈粥樣硬化斑塊的形成[9]。頸動脈粥樣硬化是中老年人常見血管病變，且約60%的缺血性腦卒中患者伴有頸動脈粥樣硬化。近年涉及NAD(P)H氧化酶p22phox亞基遺傳變異性與頸動脈粥樣硬化的關系研究國內(nèi)外已有報道，但C242T基因多態(tài)性與頸動脈粥樣硬化之間的相關性研究存在爭議較大，可能與研究人群的地區(qū)及種族差異有關[10-11]，且-A930G與頸動脈粥樣硬化之間的研究報道甚少。

血脂代謝異常是動脈粥樣硬化斑塊形成過程中的必要條件。血清ApoB水平反映了具有潛在致動脈粥樣硬化功能的血脂如LDL、中等密度脂蛋白及VLDL的水平。相反，ApoA攜載的是HDL顆粒，其血清水平則反映了具有血管保護作用的HDL顆粒水平，且與頸動脈粥樣硬化斑塊形成程度呈負相關[12]。研究發(fā)現(xiàn)被氧自由基介導氧化所形成的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)可導致動脈粥樣硬化效應增強[13]，而HDL經(jīng)氧化修飾形成氧化型高密度脂蛋白(ox-HDL)后其抗氧化、抗炎和調(diào)節(jié)膽固醇的能力將減弱，甚至消失，成為致動脈粥樣硬化的脂蛋白[14]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)NAD(P)H氧化酶p22phox亞基基因多態(tài)性可以通過影響NAD(P)H氧化酶的活性，改變脈管系統(tǒng)的氧化還原狀態(tài)而影響脂蛋白的氧化反應，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成，與大動脈粥樣硬化型缺血性腦卒中的發(fā)生相關[15]。

許多研究已證實，吸煙是動脈粥樣硬化發(fā)生的危險因素之一，NADPH氧化酶在吸煙參與的氧化應激中具有促進作用。NAD(P)H氧化酶能被吸煙的煙霧中的一些可溶性物質(zhì)激活[16]，使人和動物的血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生大量的O2-[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，在吸煙人群中NAD(P)H氧化酶p22phox亞基-A930G基因多態(tài)性與冠心病發(fā)病密切相關，G等位基因攜帶者冠心病的發(fā)生較AA基因型攜帶者顯著升高[18]。Fan等[19]的研究發(fā)現(xiàn)在芬蘭青年人群雖然只有13.7%的高血壓病患者和0.9%的糖尿病患者，但吸煙的比例高達52.8%。有研究發(fā)現(xiàn)，吸煙者頸動脈平均和最大內(nèi)膜中層厚度(Intima-media thickness,IMT) 較非吸煙者明顯增厚，而且在吸煙人群中NAD(P)H氧化酶p22phox亞基-A930G基因GG純合子基因型人群中頸動脈平均和最大IMT均較A等位基因攜帶者明顯升高(GG vs.GA+AA,P=0.021和P=0.012)；相反，在非吸煙人群中G等位基因攜帶者頸動脈平均和最大IMT較AA基因型人群低(GG + GA vs.AA,P=0.015和P=0.018)。本研究也發(fā)現(xiàn)，G等位基因攜帶者吸煙比例較AA基因型高。Logistic回歸顯示，吸煙、G等位基因均可能是頸動脈粥樣硬化發(fā)生的危險因素。

San等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性高血壓病患者攜帶有GG基因型的個體NAD(P)H氧化酶亞基p22phox mRNA 和蛋白表達水平以及NAD(P)H氧化酶的活性均較AA+AG基因型攜帶者明顯升高，而在非高血壓病人群中GG基因型與AA+AG基因型的相比較無明顯差異。在對13項NAD(P)H氧化酶p22phox亞基-A930G基因多態(tài)性與高血壓病的相關性的meta分析中發(fā)現(xiàn)，-A930G基因多態(tài)性的GG+GA基因型頻率和G等位基因頻率均與高血壓病密切相關[4]。G等位基因在歐洲人群中的頻率是0.35，日本人群頻率是0.477，本研究結果顯示上海松江地區(qū)人群G等位基因頻率是0.388。此外，在體外細胞實驗中血管平滑肌細胞等位基因A被G取代后其基因表達水平較前提高了30%[8]。p22phox亞基-A930G基因的過度表達是NAD(P)H氧化酶活性增強的關鍵因素，NAD(P)H氧化酶活性的增加影響了血管內(nèi)皮NO合酶解耦聯(lián)，致使在高血壓病患者血管內(nèi)皮NO產(chǎn)物較正常血壓者明顯減少，導致血管內(nèi)皮活性氧產(chǎn)生增加[20]。血管內(nèi)皮ROS的產(chǎn)生誘導了血管壁的氧化應激，促進了血壓的升高,血管平滑肌細胞的增殖，加速了動脈粥樣硬化斑塊的形成。本研究中頸動脈粥樣硬化組血壓水平較對照組明顯升高。Logistic回歸顯示，高血壓病和G等位基因同樣是頸動脈粥樣硬化發(fā)生的危險因素。

綜上所述，上海松江地區(qū)漢族人群-A930G基因多態(tài)性可能與頸動脈粥樣硬化有關。頸動脈粥樣硬化組較對照組有更高的GG+AG基因型頻率及G等位基因頻率，且GG+AG基因型人群較AA基因型人群有更高的血壓水平、吸煙比例以及更低的HDL、ApoA水平。Logistic回歸分析顯示，G等位基因可能與高血壓病、吸煙以及HDL水平一樣均是頸動脈粥樣硬化的獨立危險因素，G等位基因可能會增高頸動脈粥樣硬化的發(fā)生風險，但確切機制尚不清楚?？赡芘c-A930G基因多態(tài)位點位于CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBPs)轉錄因子的結合位點上，上調(diào)了C/EBP的表達后增強了NAD(P)H氧化酶基因啟動子G等位基因的轉錄活性有關[8]。有待進一步臨床研究結合基礎實驗明確-A930G基因多態(tài)性在頸動脈粥樣硬化發(fā)病中的作用。由于本研究樣本量較小，可能存在選擇性偏倚等，尚需擴大樣本進一步證實研究結果的可靠性，為臨床頸動脈粥樣硬化及缺血性腦卒中的診治提供依據(jù)。

[1] Ma QL,Zhang GG,Peng J.Vascular peroxidase 1:a novel enzyme in promoting oxidative stress in cardiovascular system[J].Trends Cardiovasc Med,2013,23(5):179-183.

[2] 馮玉蘭,孫家蘭,嚴志敏,等.NADPH氧化酶p22phox亞基基因多態(tài)性在動脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病中的意義[J].中國臨床神經(jīng)科學,2013,21(6):649-654.

[3] Lassègue B.San martín A,griendling KK.biochemistry,physiology,and pathophysiology of NADPH oxidases in the cardiovascular system[J].Circ Res,2012,110(10):1364-1390.

[4] Qin YW,Peng J,Liang BY,et al.The-A930G polymorphism of P22phox(CYBA)gene but not C242T variation is associated with hypertension:a Meta-Analysis[J].PLoS One,2013,8(12):e82465.

[5] Niemiec P,Nowak T,Iwanicki T,et al.The-930A>G polymorphism of the CYBA gene is associated with premature coronary artery disease[J].A case-control study and gene-risk factors interactions.Mol Biol Rep,2014,41(5):3287-3294.

[6] Grant EG,Benson CB,Moneta GL,et al.Carotid artery stenosis:gray-scale and doppler US diagnosis-Society of Radiologists in Ultrasound Consensus Conference[J].Radiology,2003,229(2):340-346.

[7] 谷萬丹,高廣生,陳玉榮,等.急性腦梗死與頸動脈粥樣硬化及同型半胱氨酸、脂蛋白 a 的相關性研究[J].世界最新醫(yī)學信息文摘(電子版),2012,35(11):188-190.

[8] San José G,Moreno MU,Oliván S,et al.Functional effect of the p22phox -930A/G polymorphism on p22phox expression and NADPH oxidase activity in hypertension[J].Hypertension,2004,44(2):163-169.

[9] Bryk D,Olejarz W,Zapolska-Downar D.The role of oxidative stress and NADPH oxidase in the pathogenesis of atherosclerosis[J].Postepy Hig Med Dosw,2017,71(0):57-68.

[10] Farrag W,Eid M.Association of the C242T polymorphism of the p22 phox gene with advanced carotid atherosclerosis in type 2 diabetes[J].Mol Med Rep,2011,1(5):679-684.

[11] Li T,Xi HF,Luo HM,et al.Association of the NAD(P)H oxidase p22 phox gene C242T polymorphism with type 2 diabetes mellitus,diabetic nephropathy,and carotid atherosclerosis with type 2 diabetes mellitus:A meta-analysis[J].Meta Gene,2015,25(6):1-8.

[12] 于芳蘋,趙迎春,顧彬,等.急性腦梗死患者頸動脈粥樣硬化斑塊形成嚴重程度與高脂血癥的關系研究[J].腦與神經(jīng)疾病雜志,2014,22(5):363-367.

[13] Zhang YZ,Mu Q,Zhou Z,et al.Protective effect of irisin on atherosclerosis via suppressing oxidized low density lipoprotein induced vascular inflammation and endothelial dysfunction[J].PLoS One,2016,11(6):e0158038.

[14] Ding R,He ZQ,Zhu L,et al.Oxidized high-density lipoprotein accelerates atherosclerosis progression by inducing the imbalance between treg and teff in LDLR knockout mice[J].APMIS,2015,123(5):410-421.

[15] 蔣萍,李麗敏,顧彬,等.上海松江地區(qū)漢族人群NAD(P)H氧化酶C242T基因多態(tài)性與高脂血癥及腦梗死的相關性研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學雜志,2016,15(2):164-171.

[16] Cheng SE,Lee IT,Lin CC,et al.Cigarette smoke particle-phase extract induces HO-1 expression in human tracheal smooth muscle cells:role of the c-Src/NADPH oxidase/MAPK/Nrf2 signaling pathway[J].Free Radical Biology and Medicine,2010,48(10):1410-1422.

[17] Jaimes EA,Demaster EG,Tian RX,et al.Stable compounds of cigarette smoke induce endothelial superoxide anion production via NADPH oxidase activation[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24(6):1031-1036.

[18] Niemiec P,Nowak T,Iwanicki T,et al.The-930A > G polymorphism of the CYBA gene is associated with premature coronary artery disease.a case-control study and gene-risk factors interactions[J].Mol Biol Rep,2014,41(5):3287-3294.

[19] Fan M,Raitakari OT,K?h?nen M,et al.The association between cigarette smoking and carotid intima-media thickness is influenced by the -930A/G CYBA gene polymorphism:the Cardiovascular Risk in Young Finns Study[J].Am J Hypertens,2009,22(3):281-287.

[20] Landmesser U,Dikalov S,Price SR,et al.Oxidation of tetrahydrobiopterin leads to uncoupling of endothelial cell nitric oxide synthase in hypertension[J].Journal of Clinical Investigation,2003,111(8):1201-1209.