金毅然 馬斌武 孫文青 韓懷欽 何仲義 牛建國

目前腦缺血已成為臨床常見多基因疾病，其發(fā)病率、致殘率、病死率逐年提高?；虻膯魏塑账岫鄳B(tài)性(SNPs)是形成個(gè)體間差異的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)。怎樣從數(shù)百萬SNP中找到確有臨床意義的功能性SNP，是個(gè)體化醫(yī)學(xué)所面臨的重大挑戰(zhàn)[1]。

功能性的SNP可能影響基因的表達(dá)水平及蛋白的活性，進(jìn)而影響其在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的功能[2]。解偶聯(lián)蛋白2(uncouple protein 2，UCP2)參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)過氧化物質(zhì)(ROS)的生成，其基因多態(tài)性(圖1)已經(jīng)被眾多研究者在不同人群中證實(shí)[3]。寧夏地區(qū)的回族人群中，腦缺血發(fā)病率在逐年升高。目前尚無UCP2基因多態(tài)性在回族人群中的分布資料。本研究以寧夏地區(qū)回族人群為研究對象，分析UCP2基因多態(tài)性在回族人群的分布特點(diǎn)及UCP2SNP與腦缺血發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

圖1 UCP2基因多態(tài)性分布位點(diǎn)示意圖

1 對象與方法

1.1 研究對象

回族腦缺血患者診斷及正常對照組：腦缺血組71例，來自2014年1月-2015年10月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院就診的寧夏地區(qū)回族住院患者，年齡50～65歲，均行顱腦CT和/或MRI檢查證實(shí)腦缺血，診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會腦血管病學(xué)組急性缺血性腦卒中診治指南；對照組97例，為同期門診查體寧夏回族健康者，年齡50～65歲。所有研究對象均行生化項(xiàng)目檢查并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本基因組DNA提取 采集外周血，經(jīng)抗凝后采用QIANGEN minikit按試劑盒說明書進(jìn)行基因組DNA提取，利用Nanodrop ND1000測定DNA濃度，用瓊脂糖凝膠電泳判斷DNA質(zhì)量，篩選優(yōu)質(zhì)DNA做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù) 采用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)引物。各位點(diǎn)引物序列為

UCP2-866G/A，上游引物 5’-CACGCTGCTTCTGCCAGG AC-3’；下游引物 5’-AGGCGTCAGGAGATGGACCG-3’。

Ala55Val(Exon4)，上游引物 5’-CTCCTCTTGGCTTAGATTCCTG-3’；下游引物 5’-GACAGAATCATACAGGCCGAT-3’。

Ins/Del(Exon8)，上游引物 5’-TGCCCTCCTTTCTCCGCTTG-3’；下游引物 5’-ATGGACCAGATGACCTACACG-3’。

采用常規(guī)PCR擴(kuò)增包含相應(yīng)位點(diǎn)的DNA片段。經(jīng)凝膠電鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物后經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，37 ℃ 4 h，將酶切產(chǎn)物電泳后采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)判斷基因分型。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0分析軟件，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)定為雙側(cè)P<0.05。定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，2組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，變異位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率的組間差異分析采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組基本資料比較

正常對照組性別(男/女)比例為47/50，腦缺血組性別比例為37/34；正常對照組年齡(57.55±3.66)歲，腦缺血組年齡(58.68±3.86)歲；正常對照組體重(64.15±8.63)kg，腦缺血組體重(65.58±8.25)kg；2組在性別比例、年齡及體重等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)方面無明顯差異(P>0.05)。腦缺血組血清甘油三酯含量(1.62±0.58) mmol/L高于正常對照組(1.62±0.58) mmol/L(P<0.05)，但2組血清總膽固醇水平無明顯差異(P>0.05)(表1)。

表1 腦缺血組及正常對照組基本資料比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05

2.2 UCP2-866G/A在寧夏地區(qū)回族正常人群、腦缺血患者分布特點(diǎn)及其與回族人群腦缺血的相關(guān)性

在回族正常人群中UCP2-866位點(diǎn)基因型GG、AA、GA的分布頻率分別為23.71%，24.74%，51.55%；在腦缺血患者中分布頻率分別為30.98%，21.13%，47.89%。2組頻率分布無明顯差異(P>0.05)(表2)。

表2 回族正常人群及腦缺血患者UCP2-866G/A基因型分布特點(diǎn)[n(%)]

在回族正常人群中UCP2-866位點(diǎn)等位基因G、A的分布頻率分別為49.48%，50.52%；在腦缺血患者中分布頻率分別為54.93%，45.07%。2組等位基因型G、A的分布頻率無明顯差異(P>0.05)(表3)。

表3 回族正常人群及腦缺血患者UCP2-866G/A等位基因分布特點(diǎn)[n(%)]

2.3 UCP2Ala55Val在寧夏地區(qū)回族正常人群及腦缺血患者分布特點(diǎn)及其與回族人群腦缺血的相關(guān)性

在回族正常人群中UCP2Ala55Val基因型Ala/Ala、Ala/Val、Val/Val的分布頻率分別為31.96%，49.48%，18.56%；在腦缺血患者中分布頻率分別為32.39%，46.48%，21.13%。2組分布頻率無明顯差異(P>0.05)(表4)。

表4 回族正常人群及腦缺血患者UCP2Ala55Val基因型分布特點(diǎn)[n(%)]

在回族正常人群中UCP2Ala55Val等位基因C、T的分布頻率分別為56.70%，43.30%；在腦缺血患者中分布頻率分別為55.63%，44.37%。2組等位基因型C、T的分布頻率無明顯差異(P>0.05)(表5)。

表5 回族正常人群及腦缺血患者UCP2Ala55Val等位基因分布特點(diǎn)[n(%)]

2.4 UCP2Ins/Del在寧夏地區(qū)回族正常人群及腦缺血患者分布特點(diǎn)及其與回族人群腦缺血的相關(guān)性

在回族正常人群中UCP2Ins/Del位點(diǎn)基因型Del/Del、Ins/Del、Ins/Ins的分布頻率分別為49.5%，41.2%，9.3%；在腦缺血患者中分布頻率分別為47.9%，42.3%，9.8%。2組頻率分布無明顯差異(P>0.05)(表6)。

表6 回族正常人群及腦缺血患者UCP2Ins/Del基因型分布特點(diǎn)[n(%)]

在回族正常人群中UCP2Ins/Del等位基因Ins、Del的分布頻率分別為70.10%，29.90%；在腦缺血患者中分布頻率分別為69.01%，30.99%。2組等位基因型Ins、Del的分布頻率無明顯差異(P>0.05)(表7)。

表7 回族正常人群及腦缺血患者UCP2Ins/Del等位基因分布特點(diǎn)[n(%)]

3 討 論

研究者們對于基因的各種功能以及基因與疾病的發(fā)生和治療的關(guān)系等仍在進(jìn)一步的探索中。人類的基因組序列存在個(gè)體差異，包括對疾病的易感性、對同一疾病治療藥物的反應(yīng)性等。基因的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是形成個(gè)體間差異的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)，基于SNP分析的個(gè)體化醫(yī)療特點(diǎn)已經(jīng)基本確立[4]。

UCP2是線粒體陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白家族中的一員，它存在于線粒體內(nèi)膜上。研究證明，UCP2參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)過氧化物質(zhì)(ROS)的生成[5]。Negre-Salvayre等用GDP抑制多種組織線粒體中UCP2的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMP 增高，線粒體內(nèi)ROS的產(chǎn)生也明顯增加[6]?；蚯贸男∈笠葝u細(xì)胞中的活性氧水平明顯升高[7]。腦缺血后細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多或清除能力減弱導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞對缺血的易感性升高，將對機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害。研究者證實(shí)，UCP2通過參與神經(jīng)元線粒體氧化磷酸化過程來降低神經(jīng)元ROS水平[3]。本課題組在以往研究中發(fā)現(xiàn),腦缺血后小鼠海馬神經(jīng)元DNA過氧化損傷與UCP2基因表達(dá)水平相關(guān)[8]。

功能性的SNP可能影響基因的表達(dá)水平及蛋白的活性，進(jìn)而影響其在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的功能[9]。UCP2 基因的多態(tài)性已經(jīng)被眾多研究者在不同人群中證實(shí)。國內(nèi)學(xué)者曾經(jīng)分析了UCP2 基因的多態(tài)性在北京地區(qū)人群的分布特點(diǎn)[10]。UCP2-866G/A，UCP2 Ala55Val和UCP2 Ins/Del被證明在一些特定人群與糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[11]。以上3個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性直接影響UCP2基因表達(dá)水平及蛋白功能，影響細(xì)胞的能量代謝。雖然腦缺血的發(fā)病亦與機(jī)體細(xì)胞能量代謝水平紊亂相關(guān)，但是本研究結(jié)果表明UCP2-866G/A，UCP2 Ala55Val和UCP2 Ins/Del多態(tài)性與寧夏地區(qū)回族人群腦缺血發(fā)病無明顯相關(guān)性。

本研究首次以寧夏地區(qū)回族人群為研究對象，分析了UCP2 基因多態(tài)性在回族人群的分布特點(diǎn)及UCP2 SNP與腦缺血發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，為我區(qū)臨床防治回族人群腦缺血提供遺傳學(xué)資料。

[1] 吳濤,邱石,宋莉,等.單核苷酸多態(tài)性rs1885068與不同卒中亞型長期預(yù)后的關(guān)系[J].中國分子心臟病學(xué)雜志,2016,3(4):1782-1786.

[2] Yao L,Tak YG,Berman BP,et al.Functional annotation of colon cancer risk SNPs[J].Nat Commun,2014,5(5114):5114.

[3] Phulukdaree A,Moodley D,Khan S,et al.Uncoupling protein 2 -866G/A and uncoupling protein 3 -55C/T polymorphisms in young South African Indian coronary artery disease patients[J].Gene,2013,524(2):79-83.

[4] Ogura Y,Kou I,Miura S,et al.A functional SNP in BNC2 is associated with adolescent idiopathic scoliosis[J].Am J Hum Genet,2015,97(2):337-342.

[5] Hass DT,Barnstable CJ.Uncoupling protein 2 in the glial response to stress:implications for neuroprotection[J].Neural Regeneration Research,2016,11(8):1197-1200.

[6] Nègre-Salvayre A,Hirtz C,Carrera G,et al.A role for uncoupling protein-2 as a regulator of mitochondrial Hydrogen peroxide Generation[J].FASEB J,1997,11(10):809-815.

[7] Krauss S,Zhang CY,Lowell BB.A significant portion of mitochondrial proton leak in intact thymocytes depends on expression of UCP2[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(1):118-122.

[8] Liang X,Nagai A,Sheikh AM,et al.Increased vulnerability of hippocampal CA1 neurons to hypoperfusion in ataxia and male sterility (AMS) mouse[J].Brain Res,2013,1494(2013):109-117.

[9] Zhou Y,Simmons D,Hambly BD,et al.Interactions between UCP2 SNPs and telomere length exist in the absence of diabetes or pre-diabetes[J].Sci Rep,2016,6(33147):1-7.

[10] 王曉霞,鮮彤章,王松嵐,等.北京地區(qū)人群解偶聯(lián)蛋白2基因啟動子-866G/A變異與2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(24):4754-4758.

[11] De Souza BM,Brondani LA,Bou?as AP,et al.Associations between UCP1 -3826A/G,UCP2 -866G/A,Ala55Val and Ins/Del,and UCP3 -55C/T polymorphisms and susceptibility to type 2 diabetes mellitus:case-control study and meta-analysis[J].PLoS One,2013,8(1):e54259.