牛鵬飛 ，李 珍 ，馬海林 ，田承華 ，程慶軍 ，胡振鑫 ，趙 寧 ，張秦瑩 ，于美珍 ，李 南 ，閆 楓 ，屈雅娟 ，岳忠孝 ，田懷東 ，4

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西大豐種業(yè)有限公司，山西太原030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所，山西晉中030600；4.山西景康農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣有限公司，山西壽陽(yáng)045400）

玉米是主要的糧食作物，在養(yǎng)殖業(yè)、釀造業(yè)、食品科學(xué)、醫(yī)藥等方面有著諸多的重要作用，在經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有十分重要的地位[1]。近年來(lái)，隨著作物研究由基因組學(xué)轉(zhuǎn)向蛋白組學(xué)，玉米科學(xué)研究開(kāi)始跨入基因功能組學(xué)與分子育種時(shí)代，為此，我們有必要通過(guò)高效的基因誘變技術(shù)開(kāi)發(fā)大量的基因誘變材料[2-4]。

化學(xué)誘變主要基于烷化劑等化學(xué)誘變劑處理植株的組織器官或細(xì)胞誘發(fā)突變，因其操作簡(jiǎn)單安全、誘變效率較高成為開(kāi)發(fā)作物基因突變材料的有效途徑[5]。自NEUFFER[6]1963年首次將EMS用于玉米誘變后，經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)完善，通過(guò)懸浮于輕質(zhì)石蠟油的EMS處理玉米離體花粉進(jìn)行誘變的技術(shù)獲得了成功，并應(yīng)用于玉米突變體的開(kāi)發(fā)[7]。玉米突變體的利用促進(jìn)了一些關(guān)于玉米植株與籽粒外觀形狀的基因的功能解析，然而，絕大部分玉米的生物學(xué)功能仍然是未知的，造成這種情況的主要原因是基于低效率基因誘變技術(shù)突變材料的嚴(yán)重不足。為滿足當(dāng)前及以后一段時(shí)期內(nèi)玉米基因功能解析和分子育種研究對(duì)基因突變材料的大量需求，迫切需要研究高效的基因化學(xué)誘變技術(shù)[8-10]。

玉米花粉EMS石蠟油誘變技術(shù)成功解決了玉米離體花粉化學(xué)誘變的難題，然而石蠟油這樣的有機(jī)溶媒環(huán)境，明顯不利于誘變劑EMS對(duì)花粉生殖細(xì)胞的滲透與DNA的作用。我們認(rèn)為這是制約玉米花粉EMS石蠟油誘變效率的主要問(wèn)題。為了開(kāi)發(fā)水性環(huán)境中玉米花粉生殖細(xì)胞的化學(xué)誘變處理新技術(shù)，本研究確立了保持玉米自交系離體成熟花粉活力的最優(yōu)保護(hù)液體系。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

將優(yōu)異玉米自交系A(chǔ)378種植于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所試驗(yàn)研究基地，采集適量成熟玉米花粉并完成以下試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 用于離體玉米花粉處理的系列水性環(huán)境設(shè)計(jì)及其活力的顯著性分析 處于水性環(huán)境下的離體玉米花粉，受滲透壓作用，極易吸水脹破，降低活力。相關(guān)報(bào)告指出，蔗糖（Suc）[11]、甘油（Glycerol）[12]、乙二醇（EG）[13]、二甲基亞砜（DMSO）[14]4種成分對(duì)冷存狀態(tài)下的生體細(xì)胞具有各自的保護(hù)效果；玻璃化保護(hù)液處理下可顯著提高離體高粱花粉的活力[15]。據(jù)此，設(shè)計(jì)磷酸鹽溶液（PBS）與含有上述物質(zhì)的3種玻璃化保護(hù)液配方（PSS），構(gòu)建系列的水性環(huán)境體系。將定量提取的成熟花粉浸沒(méi)在4種水性環(huán)境體系中，以存活率評(píng)價(jià)浸沒(méi)后的花粉活力，確定玉米離體成熟花粉的最優(yōu)PSS體系。

1.2.2 最優(yōu)PSS保護(hù)下處理后玉米花粉的萌發(fā)與受精的顯微觀察 使用軟質(zhì)毛筆刷將適宜置換培養(yǎng)后的離體成熟花粉輕輕蘸抹在花絲上[16]。采用苯胺藍(lán)染色，熒光顯微鏡下觀察玉米離體花粉的體外萌發(fā)狀態(tài)[17-18]。取受粉后0～24 h內(nèi)若干發(fā)育時(shí)期的花絲，經(jīng)適宜的FAA固定、酒精置換、NaOH軟化、苯胺藍(lán)染色、制片，使用熒光顯微鏡，觀察花粉在花絲的萌發(fā)過(guò)程。取授粉24 h后若干發(fā)育時(shí)期的胚囊，經(jīng)FAA固定、酒精置換、苯胺藍(lán)染色后，再度進(jìn)行酒精置換，進(jìn)行雙受精及受精后細(xì)胞組織發(fā)育過(guò)程的光學(xué)顯微觀察。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

使用光學(xué)顯微鏡觀察被浸沒(méi)花粉的存活狀態(tài)，采用TTC法檢測(cè)花粉活力[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0軟件分析花粉活力變化的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種水性環(huán)境中離體玉米花粉存活率的解析

從表1可以看出，離體玉米花粉經(jīng)不同水性環(huán)境處理后，TTC染色結(jié)果顯示，離體玉米花粉經(jīng)PBS處理后，花粉出現(xiàn)大量脹破現(xiàn)象，存活率較低，僅為35.67%。經(jīng)3種水性環(huán)境PSS處理后，花粉活力呈上升趨勢(shì)。各水性環(huán)境體系保持受處理玉米花粉活力的能力大小順序?yàn)镻SS1＞PSS2＞PSS3＞PBS。結(jié)果表明，保護(hù)液處理后有助于提高離體玉米花粉存活率。

表1 不同水性環(huán)境處理后花粉活力的變化 %

對(duì)表1進(jìn)行花粉活力變化的顯著性分析得出，磷酸鹽緩沖液（PBS）與3種保護(hù)液體系（PSS1，PSS2，PSS3）的系列水性環(huán)境下離體玉米花粉的存活率呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)趨勢(shì)；經(jīng)過(guò)PSS處理后，3種保護(hù)液處理下的玉米離體花粉的存活率與PBS相比均有所上升。其中，PSS1，PSS2對(duì)離體花粉存活率影響均顯著，且PSS1＞PSS2，PSS3與PBS相比對(duì)離體花粉存活率的影響不顯著（圖1）。綜合分析表明，與PBS相比，PSS3對(duì)受處理花粉存活率的提高不顯著，而PSS1可顯著提高受處理花粉的存活率。

2.2 最優(yōu)PSS1處理后離體玉米花粉的萌發(fā)、受精及結(jié)籽能力的分析

圖2-A顯示，離體玉米花粉經(jīng)PBS處理后，花粉顆粒吸水脹破，內(nèi)容物外流，導(dǎo)致其失活不能被染色而呈黑色，該條件下玉米花粉存活率極低。圖2-B顯示，經(jīng)最優(yōu)PSS1處理后，玉米花粉顆粒形態(tài)得到明顯改觀，能保持較完整的形態(tài)，且大部分染色為淡紅色，大大提高了離體玉米水性環(huán)境下的存活率，從形態(tài)上表明，經(jīng)PSS1保護(hù)液處理后離體玉米花粉具有正常的形態(tài)及較高的活力。

將經(jīng)最優(yōu)水性PSS1保護(hù)的離體玉米花粉，人工涂抹于成熟玉米花絲上，在適宜的條件下仍具備較高的萌發(fā)能力（圖3-A）。圖3-B顯示，光學(xué)顯微鏡下可觀察到大量離體玉米花粉的萌發(fā)，經(jīng)水溶性苯胺藍(lán)染色后，熒光顯微鏡下可看到清晰明亮的綠白色熒光，即為萌發(fā)的花粉管。在熒光顯微鏡下觀察人工授粉后采集的各時(shí)期的樣品（圖3-C），可清晰地觀察到綠白色熒光，并觀察到花粉粒附著在花絲上，萌發(fā)出花粉管，花粉管沿花絲向下部伸長(zhǎng)，花粉管從珠孔延伸進(jìn)入子房?jī)?nèi)部（圖3-C），預(yù)示著經(jīng)最優(yōu)PSS處理后的玉米離體花粉體外授粉、受精過(guò)程的順利完成。大田試驗(yàn)結(jié)棒率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，自然授粉結(jié)棒率為100%；經(jīng)PBS處理的玉米離體花粉結(jié)棒率13%；經(jīng)最優(yōu)PSS1處理離體玉米花粉的結(jié)棒率68%。研究結(jié)果表明，最優(yōu)PSS1保護(hù)的玉米離體花粉在適宜條件下具備優(yōu)良的萌發(fā)受精能力且有較高的結(jié)實(shí)率。

3 結(jié)論與討論

玉米離體花粉處于水性環(huán)境時(shí)極易吸水脹破死亡。相關(guān)報(bào)道指出，玻璃化保護(hù)液PVS1對(duì)離體高粱花粉活力具有較明顯的保護(hù)作用[15]。本研究結(jié)果顯示，雖然受處理花粉的活力在上述水性環(huán)境中均顯著降低，但PSS中的二甲基亞砜、甘油、乙二醇、蔗糖對(duì)受處理的玉米花粉有各自的保護(hù)效果。DMSO可以減輕自由基對(duì)細(xì)胞的破壞，改變生物膜對(duì)電解質(zhì)通透性，減緩水分子對(duì)細(xì)胞的作用，達(dá)到較強(qiáng)的滲透保護(hù)作用；Glycerol與水分子具有較強(qiáng)的親和性，并在細(xì)胞外壁形成保護(hù)膜來(lái)減少水分子對(duì)細(xì)胞的侵害，降低外界對(duì)其的損傷；EG具有較高的滲透作用，通過(guò)置換出自由水達(dá)到改變胞內(nèi)鹽溶質(zhì)濃度的作用；蔗糖的大分子量保證其不易滲透進(jìn)入細(xì)胞，可以起到維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡、防止細(xì)胞過(guò)度膨脹的作用。

綜上所述，最優(yōu)PSS1保護(hù)液可顯著提高離體玉米花粉的活力，對(duì)離體玉米花粉活力的保護(hù)效果最好?；诖耍覀兤谕诖搜芯拷Y(jié)果的基礎(chǔ)上，為水性溶液環(huán)境下玉米離體生殖細(xì)胞的誘變提供借鑒，開(kāi)發(fā)出高效、安全的基因化學(xué)誘變新技術(shù)。本研究解決了水性環(huán)境體系下玉米離體花粉最優(yōu)保護(hù)液配方的難題，為玉米離體花粉生殖細(xì)胞化學(xué)誘變處理技術(shù)的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)，對(duì)基因功能組學(xué)與分子育種研究具有重要意義。

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