朱群英，張亞鋒，蘇超男，謝錦艷

(1.陜西省藥品技術(shù)審核查驗(yàn)中心，西安 710065；2.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，西安 710054；3.煙臺(tái)大學(xué)，煙臺(tái) 264005)

山藥是健脾補(bǔ)氣的良藥，是傳統(tǒng)的保健食品，臨床上常與胃腸飲同用治療脾胃虛弱、食少體倦和泄瀉等癥。山藥中含有鎂、鈉、鉀等多種對(duì)人體有益的微量元素，淀粉、蛋白質(zhì)和游離氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分以及多糖(包括黏液質(zhì)及糖蛋白)、尿囊素、山藥素和腺苷等[1-7]。其中尿囊素不僅有滋潤(rùn)皮膚的作用，還具有局麻和促進(jìn)皮膚傷口愈合的功能[8-10]；腺苷具有舒張血管、抗心律失常和保護(hù)心肌的作用。

尿囊素和腺苷極性很大，在反相色譜柱上保留時(shí)間很短，易與極性化合物同時(shí)洗脫出色譜柱，導(dǎo)致分離效果不佳[11-12]。親水性高效液相色譜采用強(qiáng)極性固定相，結(jié)合高比例有機(jī)相和低比例水相組成的流動(dòng)相對(duì)高極性化合物實(shí)現(xiàn)有效分離，對(duì)于強(qiáng)極性化合物具有很好的保留和高分離選擇性，對(duì)中藥復(fù)雜組分中強(qiáng)極性化合物的分析有較大優(yōu)勢(shì)[13-19]。本文采用親水性高效液相色譜對(duì)尿囊素和腺苷實(shí)現(xiàn)同時(shí)分離與測(cè)定，建立山藥中尿囊素和腺苷的質(zhì)量分析方法，該方法簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確。本方法可為含山藥藥材、飲片及其制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260型液相色譜儀配置二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)；KQ-300VDB雙頻數(shù)控型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ME204E萬(wàn)分之一電子天平、MS105十萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2試藥 尿囊素對(duì)照品(批號(hào)1501-200001)、腺苷對(duì)照品(批號(hào)110879-200202)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。10批山藥飲片均購(gòu)自本市藥店，經(jīng)西安市食品藥品檢驗(yàn)所謝志民主任中藥師鑒定為山藥Rhizomadioscoreae，質(zhì)量符合《中國(guó)藥典》2015年版一部要求。甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher公司)；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Waters XBridge Amide (250 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(90∶10)；流速：0.5 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；雙波長(zhǎng)檢測(cè)：224和260 nm；理論塔板數(shù)按照尿囊素峰計(jì)算不低于7 000，各色譜峰之間的分離度大于1.5。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1HPLC圖

A.對(duì)照品(224 nm)；B.對(duì)照品(260 nm)；C.樣品(224 nm)；D.樣品(260 nm)；1.腺苷；2.尿囊素。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance (224 nm)；B.reference substance (260 nm)；C.sample (224 nm)； D.sample (260 nm)；1.adenosine；2.allantoin.

2.2對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取干燥至恒質(zhì)量的尿囊素對(duì)照品和腺苷對(duì)照品10和6 mg，置于25 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈溶解，定容，分別制得含尿囊素和腺苷質(zhì)量濃度為0.4和 0.24 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別精密量取尿囊素儲(chǔ)備溶液和腺苷儲(chǔ)備溶液20和5 mL，混勻，制備尿囊素和腺苷的質(zhì)量濃度分別為320和48 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作溶液由體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈按倍數(shù)逐級(jí)稀釋得到。

2.3供試品溶液的制備 取山藥飲片粉末0.5 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈10 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，冷卻至室溫，加入體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈補(bǔ)足減失的質(zhì)量，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取2.2項(xiàng)下制備的2種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈分別稀釋成不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。按照2.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

尿囊素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):y=4.760 2x+44.629，r=0.999 3，質(zhì)量濃度在20.12～319.36 μg·mL-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

腺苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y=69.181x+130.05，r=0.999 4，質(zhì)量濃度在3.09～49.12 μg·mL-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作溶液，其中尿囊素和腺苷的質(zhì)量濃度分別為67.07和10.31 μg·mL-1，按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定尿囊素和腺苷的峰面積和保留時(shí)間，分別計(jì)算其RSD值，結(jié)果尿囊素峰面積和保留時(shí)間的RSD值分別為0.88%和0.15%，腺苷的峰面積和保留時(shí)間的RSD值分別為1.09%和0.15%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取4號(hào)樣品的供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，16和24 h進(jìn)樣，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定尿囊素和腺苷的峰面積，結(jié)果二者色譜峰面積的RSD值分別為1.08%和0.99%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取4號(hào)樣品，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定尿囊素和腺苷的峰面積，計(jì)算尿囊素和腺苷含量的RSD值分別為2.35%和2.56%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率 實(shí)驗(yàn)取4號(hào)樣品粉末0.5 g，精密稱(chēng)定，置于10 mL量瓶中，加入對(duì)照品溶液適量，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，進(jìn)樣分析，計(jì)算尿囊素和腺苷的加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.9樣品的測(cè)定 取10個(gè)不同產(chǎn)地山藥飲片按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定尿囊素和腺苷的峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算各樣品中尿囊素和腺苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2樣品中尿囊素和腺苷的含量

Tab.2 The contents of allantoin and adenosine in samples

樣品尿囊素含量/mg·g-1腺苷含量/mg·g-112．00．94024．20．12032．10．09046．20．22051．70．08561．20．07771．40．08583．00．08192．20．066103．50．130

3 討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 尿囊素和腺苷分別在224和 260 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，尿囊素在260 nm處不出峰，腺苷在224 nm處響應(yīng)較小，為了提高檢測(cè)的靈敏度，采用雙波長(zhǎng)通道進(jìn)行測(cè)定[20-21]。最終將尿囊素和腺苷的波長(zhǎng)分別設(shè)定為224和260 nm。

3.2樣品提取方法的選擇 分別考察不同濃度的甲醇和乙腈作為提取溶劑，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)不同時(shí)間，考察對(duì)提取效率的影響。結(jié)果表明，以體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈作為提取溶劑，超聲處理30 min為最佳提取方案。

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