張金蓮，蔡兆根，吳瓊，秦燕子，王夢(mèng)慧，董修芹

microRNA分子是一類(lèi)非編碼微小RNA，被臨床試驗(yàn)證實(shí)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[1-3]。let-7家族屬于microRNA中的一員。研究報(bào)道指出，let-7在肺癌和乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中呈低水平狀態(tài)，有抑制腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用[4，5]。為進(jìn)一步研究let-7家族與肝細(xì)胞癌（HCC）發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本文檢測(cè)了54例HCC患者血清和腫瘤組織let-7a和let-7b水平，并分析了其與患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年4月～2016年6月在我院接受治療的HCC患者54例，男性42例，女性12例；年齡為35～64歲，平均年齡（49.8±10.6）歲。符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)排除存在精神類(lèi)疾病或已進(jìn)行放化療者，其中TNM I期28例，Ⅱ期6例，Ⅲ～I(xiàn)V期20例；腫瘤直徑＜5 cm者23例，≥5 cm者31例；無(wú)血管浸潤(rùn)者33例，有血管浸潤(rùn)者21例。另選擇同期來(lái)我院進(jìn)行體檢的52例健康人作為對(duì)照組，男性38例，女性14例；年齡33～62歲，平均年齡（50.1±10.9）歲。兩組年齡和性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 血清和肝組織microRNA let-7a和let-7b水平檢測(cè) 采集外周血4 ml，靜置于室溫下，待血清凝固后4000 r/min離心10 min，將上層血清置入無(wú)RNA酶管。取54例HCC患者手術(shù)切除的HCC組織及其癌旁組織，-80℃貯存?zhèn)溆谩Ｌ崛NA試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司，熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)英杰公司。let-7及內(nèi)參U6購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，熒光定量PCR儀購(gòu)自Thermo-Forma公司。根據(jù)miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。建立20 μl反應(yīng)體系。反應(yīng)液配比見(jiàn)表1（冰上完成）。將上述反應(yīng)體系混合均勻，短暫離心后放置冰塊上。RT-PCR 反應(yīng)條件：溫度為16℃或42℃，30 min；85℃，5 min；4℃保存。按照 qRT-PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。建立20 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)液的配置情況見(jiàn)表2。使用Roche Light Cyeler480實(shí)時(shí)熒光定量 PCR系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)參數(shù)：第一步：95℃，10 min；第二步：95℃，15 s；60℃，45 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為參照，計(jì)算let-7a和let-7b相對(duì)水平，計(jì)算公式為 RQ=2-△△Ct，重復(fù)測(cè)量 3 次，取平均值[6]。

表1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液配比

表2PCR反應(yīng)液配比

1.3 診斷方法和病理學(xué)檢查 術(shù)前行B超和增強(qiáng)CT等影像學(xué)檢查，經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)檢查診斷[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清let-7a和let-7b水平比較 HCC患者血清let-7A和let-7b水平顯著低于健康人（P＜0.05，表3）。

2.2 HCC患者癌組織與癌旁組織let-7a和let-7b水平比較 癌組織let-7a和let-7a水平均顯著低于癌旁組織（P＜0.05，表4）。

表3 兩組血清let-7a和let-7b水平（±s）比較

表3 兩組血清let-7a和let-7b水平（±s）比較

例數(shù)let-7a（2-△△Ct）let-7b（2-△△Ct）HCC 54 0.6±0.4 0.3±0.1健康人 52 1.1±0.4 0.7±0.2 t 6.434 13.097 P＜0.001 ＜0.001

表4 癌組織與癌旁組織let-7a和let-7b水平（±s）比較

表4 癌組織與癌旁組織let-7a和let-7b水平（±s）比較

差異表達(dá)倍數(shù)（fold change）表示癌組織/癌旁組織let-7a和let-7b水平差異的倍數(shù)，其值≥2表示有差異，負(fù)值提示低水平

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2.3 不同臨床和病理學(xué)指標(biāo)HCC患者血清let-7a和let-7b水平比較 有癌栓形成的HCC患者血清let-7a和let-7b水平顯著低于無(wú)癌栓形成患者（P＜0.05），但不同年齡、不同性別、血清AFP水平高低、腫瘤大小、不同細(xì)胞分化程度和TNM分期及有無(wú)腫瘤血管浸潤(rùn)患者血清let-7a和let-7b水平無(wú)顯著性差異（P＞0.05，表5）。

表5 不同臨床和病理學(xué)指標(biāo)HCC患者血清let-7a和 let-7b 水平（±s）比較

表5 不同臨床和病理學(xué)指標(biāo)HCC患者血清let-7a和 let-7b 水平（±s）比較

與無(wú)癌栓形成者比，①P＜0.05

?

2.4 不同臨床和病理學(xué)指標(biāo)HCC患者癌組織let-7a和let-7b水平比較 不同年齡、性別、血清AFP水平、腫瘤大小、細(xì)胞分化、TNM分期和有無(wú)血管浸潤(rùn)或癌栓形成的HCC患者癌組織let-7a和let-7b水平均無(wú)顯著性差異（P＞0.05，表6）。

表6 不同臨床和病理學(xué)指標(biāo)HCC患者癌組織let-7a和 let-7b水平（±s）比較

表6 不同臨床和病理學(xué)指標(biāo)HCC患者癌組織let-7a和 let-7b水平（±s）比較

?

3 討論

改善肝癌患者的預(yù)后是目前臨床研究的重點(diǎn)，但現(xiàn)在仍缺乏能夠準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)患者預(yù)后的分子標(biāo)志[8]。miRNA是一種能夠參與生物體發(fā)育、代謝、細(xì)胞凋亡的非編碼RNA分子。報(bào)道顯示miRNA更為穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)各種環(huán)境變化仍能保持不變，可望成為可以應(yīng)用的預(yù)測(cè)腫瘤患者預(yù)后的標(biāo)志物[9,10]。let-7為發(fā)現(xiàn)較早的一種miRNA，其家族中共包含10名成員，其中l(wèi)et-7a是目前研究最多的一種miRNA。在對(duì)let-7家族的深入研究中發(fā)現(xiàn)，let-7在乳腺癌和肺癌等多種惡性腫瘤中組織均呈明顯低水平，let-7家族能夠與原癌基因 RAS、HMGA2和 C-myc的3'UTR結(jié)合，負(fù)調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)，進(jìn)而起到促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡的作用[11，12]。國(guó)外[13，14]研究顯示，let-7 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)，并能發(fā)揮抑癌基因的作用。在肺癌組織中l(wèi)et-7呈低水平狀態(tài)，且其低水平與肺癌術(shù)后患者生存期有關(guān)[15]。相關(guān)研究還指出，let-7a可以抑制肺癌和直腸癌等腫瘤的生長(zhǎng)[16-18]。

本研究結(jié)果顯示，HCC患者血清 let-7a和let-7b水平明顯低于健康人（P＜0.05）；HCC患者肝癌組織let-7a和let-7b水平比癌旁組織呈明顯的下調(diào)趨勢(shì)，提示血清和癌組織let-7a和let-7b水平可能為HCC患者重要的血清分子生物學(xué)指標(biāo)，對(duì)早期診斷HCC的疾病進(jìn)展具有參考價(jià)值。單因素分析發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清let-7a和let-7b水平與腫瘤患者門(mén)靜脈癌栓存在一定的關(guān)系。肝癌患者癌組織let-7a和let-7b相對(duì)水平與患者血清水平相一致,即癌組織let-7a和let-7b水平也降低。單因素分析結(jié)果還顯示，血清和組織let-7a和let-7b水平在不同年齡、不同性別、血清AFP水平高低、腫瘤大小、不同細(xì)胞分化程度和TNM分期及有無(wú)腫瘤血管浸潤(rùn)患者無(wú)顯著性差異（P＞0.05），其結(jié)果還有待驗(yàn)證。癌栓是一種出現(xiàn)于微循環(huán)、淋巴管和大小動(dòng)靜脈的栓子。由于在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，淋巴和血管受癌細(xì)胞侵犯，出現(xiàn)凝血功能異常和血流動(dòng)力學(xué)障礙，還可導(dǎo)致血栓形成。本研究結(jié)果顯示，有癌栓形成的患者血清let-7a和let-7b水平降低，可能原因?yàn)榈退降膌et-7a和let-7b對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用減弱，使得惡性腫瘤細(xì)胞加速生長(zhǎng)、侵襲和擴(kuò)散，進(jìn)而影響局部血流動(dòng)力學(xué)，形成癌栓。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道[19-22]顯示，let-7a水平與HCC患者腫瘤大小存在相關(guān)性，而本組血清let-7a和let-7b水平在不同腫瘤大小等各項(xiàng)臨床指標(biāo)患者間無(wú)顯著差異，可能與本研究選擇的病例數(shù)、取樣時(shí)間和檢測(cè)方法的可靠性等因素有關(guān)，說(shuō)明HCC患者血清let-7a水平還容易受到多種因素的干擾。

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