夏理海，羅 凱，李由申，韓盼盼，黎 明，郜衛(wèi)華，許巧情，2，胡 偉，2

（1.長江大學濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北荊州434025；2.長江大學動物科學學院，湖北荊州434025）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）為革蘭氏陰性菌，隸屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）克雷伯菌屬（Klebsiella），由Friendiander于1893年從患大葉性肺炎病人的肺組織中首次分離到［1］。該細菌廣泛分布于自然界，近年來成為僅次于大腸桿菌的最重要的條件致病菌［2－4］。該菌最適生長溫度為37℃，最適 pH值為 7.0～7.6［1］。肺炎克雷伯菌可在全身各部位發(fā)生感染，可引起肺炎、腦膜炎、肝膿腫、眼內(nèi)炎等，且發(fā)病死亡率極高［5］。

黑斑蛙（Pelophylax nigromaculatus）俗稱田雞、青蛙，屬蛙科側褶蛙屬的兩棲動物，廣泛分布于我國各地區(qū)（除海南、云南、臺灣地區(qū)）［6］。野生黑斑蛙為國家二級保護動物，以稻田、水塘等水域為繁殖生存和捕食活動的主要場所［7］。目前，我國黑斑蛙人工養(yǎng)殖處于起步階段，屬于朝陽產(chǎn)業(yè)，市場前景廣闊［8］。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大、集約化程度的不斷提高，其疾病也頻繁發(fā)生。已有報道稱，藤黃葡萄球菌、淺黃假單胞菌和氣單胞菌可引起牛蛙的歪頭病和白內(nèi)障?。?－10］，布氏檸檬酸桿菌和腦膜炎敗血金黃桿菌可引起棘胸蛙的白內(nèi)障病和歪頭?。?1－12］，腦膜炎敗血黃桿菌可引起虎紋蛙的白內(nèi)障病［13］，金黃色葡萄球菌可引起棘腹蛙的白內(nèi)障病等［14］。但是，對黑斑蛙相關疾病的研究少見報道。本研究采用16S rRNA基因同源性分析法和系統(tǒng)發(fā)育樹分析法對湖北松滋鑫滿塘生態(tài)養(yǎng)殖公司發(fā)病黑斑蛙進行病原菌分離、鑒定，旨在為該病的確診和防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病蛙的來源

患病黑斑蛙于2016年9月15日從湖北松滋鑫滿塘生態(tài)養(yǎng)殖公司稻、鰍、蛙連作基地取回，體質(zhì)量為 100～150 g／只。

1.2 主要試劑

牛肉膏蛋白胨肉湯培養(yǎng)基（LB）、諾氟沙星、多粘菌素B、頭孢曲松、萬古霉素、復方新諾明、氧氟沙星、四環(huán)素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、丁胺卡納等10種抗菌藥物藥敏紙片，購自杭州微生物有限公司；dNTP（2.5 mmol／L）、Easy Taq酶（5 U／μL）、10×Easy Taq Buffer（1.2mL），均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 細菌的分離與培養(yǎng)

取典型白內(nèi)障病黑斑蛙，在無菌環(huán)境中分別從其皮膚、眼、肝、肺、胃、腸和心取材，并置于 1.5 mL EP管中，加入1 mL LB液體培養(yǎng)基，用組織勻漿機將樣品攪碎，1 200 r／min短暫離心取上清進行LB培養(yǎng)基平板劃線分離，37℃、200 r／min培養(yǎng)12～24 h，挑選單菌落進行純化培養(yǎng)和鑒定。

1.4 病原菌16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析

在無菌環(huán)境下，挑取單克隆到1.5 mL EP管中并加入1 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃、200 r／min培養(yǎng)12～24 h，待菌液渾濁后于1 200 r／min短暫離心棄上清，以16S rRNA通用引物進行PCR擴增，擴增體系采用25μL的反應體系，其擴增程序如下：95℃10 min；95℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，共進行32個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后交由武漢擎科生物工程有限公司進行序列測定。將測序得到的16S rRNA基因序列與GenBank中已知核酸序列進行Blast分析，選取同源性較高的序列在MEGA 5.1軟件上完成序列的比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。

1.5 病原菌的特異性檢測

病原菌測序得到的16S rRNA基因序列與GenBank中已知核酸序列進行Blast分析后，使用特異性引物khe對其進行特異性檢測和驗證。

1.6 藥敏試驗

測序鑒定后，吸取適量菌液均勻地涂布于LB培養(yǎng)基平板上，用無菌鑷子取待測藥敏紙片（直徑6 mm），將其緊貼于LB培養(yǎng)基表面，并將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑（mm）［15］。

1.7 PCR引物的設計與合成

16SRNA細菌引物序列由中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所提供，特異引物khe參照艾克特等的方法［16］進行設計，均由擎科生物技術有限公司合成。引物序列見表1。

表1 PCR擴增用引物

2 結果與分析

2.1 黑斑蛙白內(nèi)障病的主要癥狀

白內(nèi)障病是目前黑斑蛙養(yǎng)殖過程中常見的流行病，病蛙厭食懶動，應急能力差，身體失去平衡，游動時身體打轉，最明顯的癥狀為眼球發(fā)白，頭部歪曲。此外經(jīng)解剖后，由圖1可知，病蛙出現(xiàn)肝花白或充血，肺腫大等病變。

2.2 16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析結果

PCR擴增分離細菌的16S rRNA基因，得到的片段長度約為1 400 bp，與預期目標產(chǎn)物的大小一致，電泳結果見圖2。PCR產(chǎn)物經(jīng)武漢擎科生物公司測序后，用Blast對分離細菌的16S rDNA序列進行比對，結果表明，分離菌株與肺炎克雷伯菌相似性為99%。選取同源性較高的菌株，以維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）作為外類群，構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。這些細菌聚為3組，1組是肺炎克雷伯菌，1組是產(chǎn)酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca），1組是維氏氣單胞菌。分離的菌株與肺炎克雷伯菌處于同一分支上，親緣關系最近，命名為9HeiBan Frog Heart。經(jīng)16S rRNA測序與系統(tǒng)聚類鑒定表明，該病原菌為肺炎克雷伯菌屬，使用肺炎克雷伯菌特異引物khe對其進行特異性擴增，得到片段大小為475 bp，與目標產(chǎn)物大小一致，電泳結果見圖4，進一步確定該菌株為肺炎克雷伯菌。

2.3 藥敏試驗結果

用10種水產(chǎn)常用抗菌藥物的藥敏紙片做敏感性試驗，表2結果顯示，肺炎克雷伯菌對諾氟沙星、頭孢曲松、氧氟沙星、環(huán)丙沙星及丁胺卡納等5種藥物敏感；對多黏菌素B和四環(huán)素等2種藥物中度敏感；對萬古霉素、復方新諾明及多西環(huán)素3種藥物耐藥。

表2 藥敏試驗結果

3 討論與結論

3.1 黑斑蛙“白內(nèi)障（歪頭）”病的命名

黑斑蛙“白內(nèi)障（歪頭）”病是以患病黑斑蛙眼球發(fā)白、頭向一側歪斜這一明顯癥狀而命名的，如已報道的牛蛙“白內(nèi)障”?。?0］、棘胸蛙“白內(nèi)障”?。?1］、虎紋蛙“白內(nèi)障”?。?3］、牛蛙“歪頭”?。?］、牛蛙“腹水”?。?7］等均是細菌性疾病，同樣，在養(yǎng)殖魚類中也存在“白內(nèi)障”這一說法，但魚類“白內(nèi)障”病卻是由寄生引起的［18］。雖然致病病原不一樣，但均有某一明顯癥狀，研究者以該癥狀對其進行命名。故此，本研究也以同樣的方法將黑斑蛙所患疾病命名為“白內(nèi)障（歪頭）”病。

3.2 肺炎克雷伯菌對黑斑蛙的影響

肺炎克雷伯菌為革蘭氏陰性菌，兼性厭氧，廣泛存在于水和土壤等微生態(tài)環(huán)境中，可感染全身各部［19］。本研究從病蛙多部位分離細菌經(jīng)測序分析為同一種細菌——肺炎克雷伯菌。根據(jù)患病黑斑蛙的外觀癥狀及測序結果可知，肺炎克雷伯菌對黑斑蛙的感染是多部位的，并非局部感染，產(chǎn)生的病癥也多樣化。同時，該病菌對水生動物健康和實踐生產(chǎn)的危害也是巨大的。

3.3 病原菌的耐藥性

目前，對于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病大多仍采用抗菌藥物來控制其發(fā)生和流行［20］，由于肺炎克雷伯菌流行廣泛，人們大量使用抗生素造成肺炎克雷伯菌耐藥性普遍存在［1］。本研究以10種常用抗菌藥物對從患病黑斑蛙各組織分離培養(yǎng)出來的細菌進行藥物敏感性檢測，結果表明，肺炎克雷伯菌對諾氟沙星、頭孢曲松、氧氟沙星、環(huán)丙沙星及丁胺卡納等5種藥物敏感；對多黏菌素B和四環(huán)素等2種藥物中度敏感；對萬古霉素、復方新諾明及多西環(huán)素3種藥物耐藥。該結果與周蓉等的結果［21－22］差異較大。由于肺炎克雷伯菌臨床分離的菌株數(shù)量繁多，可能是由于分離的菌株之間存在差異而造成的，還可能與細菌的來源和區(qū)域及感染對象的分布不同有關。因此，用藥時應在相應病原菌藥敏測定后，有針對性地選擇藥物用于黑斑蛙的養(yǎng)殖生產(chǎn)。

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