李 瑩，方旭波，周劍忠，吳佳麗，黃 瓊，劉小莉，王 英

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京210014；2.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022）

丙氨酸－組氨酸－亮氨酸－亮氨酸（Ala－His－Leu－Leu，簡(jiǎn)稱AHLL）是一種從泥鰍蛋白酶解物中提取的活性四肽，Li等發(fā)現(xiàn)其具有較高的抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性［1］，對(duì)高血壓等心血管疾病有輔助治療作用［2－3］。AHLL人工合成簡(jiǎn)單，成本較低，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。然而前期研究表明，AHLL在腸道內(nèi)會(huì)被消化系統(tǒng)中的胰酶降解，導(dǎo)致其血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，簡(jiǎn)稱ACE）抑制活性顯著下降［4］。

納米粒遞釋系統(tǒng)通過將活性物質(zhì)包封在納米粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)中，從而保護(hù)藥物不受到生物及化學(xué)降解。聚乳酸－羥基乙酸共聚物［poly（lactic－co－glycolic acid），簡(jiǎn)稱 PLGA］是由2種單體——乳酸和羥基乙酸隨機(jī)聚合而成的，是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物。PLGA具有良好的生物相容性，無毒可食用，且具有良好的成囊和成膜性能，被廣泛應(yīng)用于食品中活性物質(zhì)的包埋、制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域［5－7］。PLGA通過美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，簡(jiǎn)稱FDA）認(rèn)證，被正式作為藥用輔料收錄進(jìn)美國(guó)藥典［8］。忻娜等采用超臨界二氧化碳抗溶劑法成功制備聚乳酸－羥基乙酸共聚物包埋姜黃素的納米顆粒，姜黃素包埋率達(dá)93.89%［9］；Patel等采用 PLGA包埋色甘酸鈉，有效提高了其腸道滲透效果，色甘酸鈉－PLGA納米粒的腸細(xì)胞滲透率提高了4倍［10］；金啟星等以PLGA微球包載牛血清白蛋白，實(shí)現(xiàn)了牛血清白蛋白體外釋放速度的有效控制［11］。本研究以PLGA作為載體，對(duì)ACE抑制肽AHLL進(jìn)行活性包埋，制備AHLL的PLGA納米粒，并以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究乳化劑濃度、水油體積比、聚合物濃度、活性肽濃度等工藝因素對(duì)納米粒質(zhì)量的影響。此外，通過掃描電鏡觀察納米粒的表面形貌，測(cè)定目標(biāo)產(chǎn)物的粒徑及電位，評(píng)價(jià)納米粒體系的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AHLL（純度＞97%），上海強(qiáng)耀生物科技有限公司。聚乳酸 －羥基乙酸共聚物［m乳酸（L）∶m羥基乙酸（G）＝50∶50，分子量＝15 000］，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司；聚乙烯醇，上海源葉生物科技有限公司；丙酮、三氯乙酸，成都市科龍化工試劑廠；乙腈（色譜純），江蘇漢邦公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UniCen MR冷凍離心機(jī)，德國(guó)Herolab公司；500型精密電子天平，意大利BEL公司；SZ－1漩渦混勻器，江蘇省金壇市江南儀器廠；78－2型雙向磁力加熱攪拌器，江蘇省金壇市中大儀器廠；KQ－400KDB型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FDU－1200冷凍干燥機(jī)，日本東京Rikakikai公司；EVO LS10掃描電鏡，德國(guó)卡爾蔡司公司；Malvern Nano ZS90粒度電位儀，英國(guó)Malvern儀器公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 AHLL納米粒制備 準(zhǔn)確稱取一定量的AHLL和載體材料PLGA，將其分別溶于丙酮中，混合后構(gòu)成油相，在攪拌條件下將油相緩慢滴加到含有聚乙烯醇的水溶液中，超聲乳化一段時(shí)間，將所得的乳液在自然條件下置于恒溫磁力器上攪拌過夜，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑，將所得納米粒混懸液于4 000 r／min低速離心除去大顆粒雜質(zhì)，將上懸液于12 000 r／min高速冷凍離心30 min，用蒸餾水洗滌3次，最后將所得沉淀超聲分散在蒸餾水中，冷凍干燥48 h，即得納米粒粉末，于4℃保存于真空干燥箱中備用。

1.3.2 納米粒的粒徑分布和Zeta電位 稱取一定量的活性肽PLGA納米粒粉末，超聲分散于蒸餾水中，稀釋一定的倍數(shù)，采用激光散射粒度電位儀測(cè)定納米粒的粒徑、粒度分布及Zeta電位。

1.3.3 納米粒的表面形貌 取少量AHLL納米粒粉末，將其均勻?yàn)⒃谫N有導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上，在真空下對(duì)樣品表面進(jìn)行噴金處理，置于掃描電鏡下觀察其形貌并拍照。

1.3.4 載AHLL納米粒包封率的測(cè)定 納米粒的藥物包封率是指單位體積或質(zhì)量納米粒中被載入納米粒中的藥物量與體系中藥物總量之比。用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，簡(jiǎn)稱 HPLC）方法檢測(cè)納米粒洗液中AHLL的含量，計(jì)算包封率：

包封率＝（AHLL的投料量－未被包封的AHLL含量）／AHLL的投料量×100%。

1.3.5 高效液相色譜法測(cè)定AHLL含量 色譜柱：4.6 mm×150 mm ZORBAX XDB－C18（美國(guó)安捷倫科技有限公司）。檢測(cè)條件：流動(dòng)相A，100%乙腈［含體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，簡(jiǎn)稱 TFA］，流動(dòng)相 B，H2O（含體積分?jǐn)?shù)0.1%的 TFA）；洗脫條件為 0～10 min，0～20%A，10～30 min，20%～40%A，30～35 min，40% ～100%A；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，流速為0.5 mL／min，柱溫為35℃。用純度為99%的AHLL標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。150μL樣品經(jīng)0.45μm膜過濾，取20μL濾液進(jìn)樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的AHLL含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件做方差分析（analysis of variance，簡(jiǎn)稱ANOVA），分析比較各組之間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳化劑濃度對(duì)納米粒制備效果的影響

配制一系列不同濃度的聚乙烯醇溶液作為水相，以聚合物PLGA為載體材料，以活性肽AHLL為活性包載物，設(shè)制備中的其他組分用量不變，研究乳化劑濃度對(duì)其包封率的影響。由圖1可以看出，隨著乳化劑聚乙烯醇濃度的增加，納米粒的包封率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，這是由于當(dāng)聚乙烯醇的濃度低于臨界膠束濃度時(shí)，油相無法在水相中乳化分散，導(dǎo)致無法形成納米粒；當(dāng)聚乙烯醇的濃度增大到臨界膠束濃度時(shí)，油相液滴表面的乳化劑分布達(dá)到飽和，此時(shí)納米粒具有較大的包封率；隨著聚乙烯醇濃度的繼續(xù)增大，體系的黏度也增大，乳滴碰撞的概率提高，團(tuán)聚現(xiàn)象增多，造成納米粒的包封率逐漸降低。因此，在AHLL納米粒制備過程中，乳化劑聚乙烯醇的最佳濃度為0.02%。潘藝茗在研究姜黃素納米粒時(shí)，同樣在乳化劑維生素E聚乙二醇1000琥珀酸（TPGS）的臨界膠束濃度為0.03%左右時(shí)制備的納米粒的包封率較高［12］。

2.2 水油相體積比對(duì)納米粒制備效果的影響

設(shè)水相體積不變，改變油相體積，同時(shí)固定油相中PLGA、AHLL用量，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備納米溶液，研究水油相體積比對(duì)其包封率的影響。由圖2可以看出，隨著水油相體積比的增加，AHLL納米粒的包封率呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢(shì)。在低水油相比下，油相相對(duì)水相的濃度高，在水相中擴(kuò)散困難，體系黏度高，容易發(fā)生團(tuán)聚，形成較大的顆粒，影響納米粒的產(chǎn)率和對(duì)活性物質(zhì)的包封，因此包封率相對(duì)較低。由于本試驗(yàn)中固定丙酮中的PLGA、AHLL用量不變，所以當(dāng)水油相體積比較大，丙酮用量較小時(shí)，油相中物質(zhì)的濃度增加，油相液滴在水相中較難分散，從而導(dǎo)致納米粒的產(chǎn)率降低，對(duì)AHLL的包封效果變差，包封率明顯減小。因此，油相相對(duì)體積過高或過低都會(huì)造成包封率的降低。油相的用量存在1個(gè)臨界值，低于或高于這個(gè)值，納米粒的包封率均會(huì)降低?？梢钥闯?，在AHLL納米粒制備過程中，水相∶油相的臨界值為15∶1，此時(shí)制備的納米粒的包封率最高。

2.3 聚合物濃度對(duì)納米粒制備效果的影響

固定其他條件不變，改變油相中PLGA的濃度，研究聚合物濃度對(duì)AHLL納米粒包封率的影響。從圖3可以看出，隨著聚合物PLGA濃度的增加，納米粒的包封率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，可見包封率并不是隨著聚合物濃度的增加而增加的，研究顯示，PLGA在第一相中其包封率隨著濃度升高而升高［13］。Mao等采用O／W乳化溶劑揮發(fā)法制備阿曲生坦微球，當(dāng)控制PLGA的濃度＜30%時(shí)，微球包封率與PLGA濃度才呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系［14］。這主要是因?yàn)?，?dāng)聚合物PLGA濃度很小時(shí)，可形成AHLL納米粒的數(shù)量較少；隨著PLGA濃度的逐漸增加，AHLL納米粒的產(chǎn)率也隨之增大，對(duì)AHLL的包封率會(huì)逐漸升高。然而，當(dāng)PLGA濃度過大時(shí)，油相黏度明顯增大，在水相中分散困難，容易發(fā)生團(tuán)聚而形成較大的顆粒，會(huì)嚴(yán)重影響納米粒的產(chǎn)率和對(duì)AHLL的包封，導(dǎo)致AHLL納米粒的包封率減小。由圖3可以看出，在PLGA濃度為20%～30%的范圍內(nèi)，納米粒對(duì)AHLL的包封率較高。

2.4 AHLL濃度對(duì)納米粒制備效果的影響

固定制備過程中其他條件不變，改變AHLL在油相中的濃度，在相同試驗(yàn)條件下制備AHLL的PLGA納米溶液，測(cè)定其包封率。由圖4可以看出，隨著AHLL濃度的增大，AHLL納米粒的包封率逐漸下降。這是由于AHLL濃度增大時(shí)，包裹單位AHLL的聚合物分子數(shù)量相對(duì)變少，載體包裹AHLL的概率降低，從而導(dǎo)致AHLL包封不完全，納米粒對(duì)AHLL的包封率降低。然而，包載物濃度過低時(shí)，將造成AHLL在生物體內(nèi)的靶向作用不明顯，綜合比較后，選擇AHLL濃度為2.0%。

2.5 AHLL納米粒粒徑和粒度分布

納米粒粒徑的大小及其分布均勻程度與其穩(wěn)定性和包封率有關(guān)，也會(huì)直接對(duì)納米粒在生物體內(nèi)的行為造成影響。AHLL納米粒的粒徑及其分布如圖5所示，可見空白納米粒的平均粒徑為 186.7 nm，AHLL納米粒的平均粒徑為223.6 nm?？梢钥闯?，納米粒對(duì)AHLL的包封作用使得AHLL納米粒比空白納米粒的粒徑有所增大，同時(shí)2種納米粒的粒徑分布均較窄，且較為均一。

2.6 AHLL納米粒的表面電位分析

納米粒作為一種活性物質(zhì)的輸送體系，其表面電位是體系考察的重要因素之一。納米粒表面電位的大小體現(xiàn)了納米粒膠體溶液的穩(wěn)定性，表面電位的絕對(duì)值越大，則納米粒表面同種電荷的相互排斥力也就越大，納米粒越不容易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，能更加穩(wěn)定地分散在溶液中，整個(gè)納米粒體系的穩(wěn)定性也就越好。測(cè)定載有AHLL的PLGA納米粒和空白納米粒的表面電位，由結(jié)果可知，載有AHLL的PLGA納米粒的平均電位為 －28.7 mV，空白 PLGA納米粒的平均電位為－25.1 mV，表明AHLL經(jīng)納米粒包裹后，比空白納米粒的電位有所提高，具有更佳的納米粒體系穩(wěn)定性。

2.7 AHLL納米粒的表面形貌

納米粒表面形貌特征對(duì)其在生物體內(nèi)的靶向和分布會(huì)產(chǎn)生一定影響。載有AHLL的納米粒粉末，經(jīng)噴金處理后，置于掃描電鏡下放大不同倍數(shù)后對(duì)其表面形貌進(jìn)行觀察。由圖6（5 000×）、圖7（10 000×）可以看出，載有 AHLL的 PLGA納米粒為形狀均勻的球形，表面光滑，分散也較為均勻。

3 結(jié)論

采用乳化溶劑揮發(fā)法制備AHLL的PLGA納米粒的最優(yōu)條件如下：在室溫下，將油相緩慢滴加到水相中，勻速攪拌，油相中聚合物PLGA濃度為25%，AHLL濃度為2.0%，水相中乳化劑聚乙烯醇的臨界膠束濃度為0.02%，水油相體積比（W∶O）為15∶1，超聲乳化15 min，在自然條件下?lián)]發(fā)過夜。此時(shí)制備的納米粒為表面光滑且分散較均勻的球形，平均粒徑小，包封率大。載有AHLL的PLGA納米粒比空白納米粒的平均電位有所提高，具有更加穩(wěn)定的納米粒體系。

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