, ,,, ,,

非結(jié)核分枝桿菌(non—tuberculous mycobacterum，NTM)是指結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的其他分枝桿菌，目前已知的有150余種，為條件致病菌[1-2]。其中鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合菌組(Mycobacterium avium—intracellulare complex，MAC)、龜分枝桿菌、馬賽分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌等是主要常見致病菌[3]。NTM引起的疾病，可累及肺、淋巴結(jié)、皮膚、軟組織等器官組織，以肺部多見[2]。NTM病快速增長，已經(jīng)成為危害人類健康的公共衛(wèi)生問題[4]。非結(jié)核分枝桿菌病和結(jié)核病由于在臨床癥狀體征影像學(xué)資料、痰菌、病理活檢等方面都十分相似，在按照結(jié)核病規(guī)范療程治療后效果欠佳時(shí)，醫(yī)生往往考慮是否出現(xiàn)了廣泛耐藥結(jié)核或耐多藥結(jié)核從而可能延誤了病情。近些年來，隨著細(xì)菌分離技術(shù)的不斷提高和普及，免疫受損宿主感染菌群的變遷等原因，導(dǎo)致NTM感染和相關(guān)疾病的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢。

NTM對抗結(jié)核藥物具有極高的耐藥性，其對異煙肼、對氨基水楊酸鈉、乙胺丁醇、利福平、鏈霉素等常用抗結(jié)核藥物存在不同程度的耐藥，耐藥率高達(dá)97.46%，且大多菌株同時(shí)對多種抗結(jié)核藥物耐藥。NTM對大多數(shù)抗結(jié)核藥物天然耐藥的生理基礎(chǔ)可能是NTM細(xì)胞表面的高疏水性及細(xì)胞壁的通透屏障[3,5-6]。本實(shí)驗(yàn)采用《分枝桿菌、諾卡菌和其他需氧放線菌的藥物敏感性試驗(yàn)》第二版推薦方法微孔板阿爾瑪藍(lán)測定法。該方法使用調(diào)過陽離子含5%OADC的MH肉湯(CAMHB)培養(yǎng)基，同時(shí)使用阿爾瑪藍(lán)指示劑，大大的提高了檢測的靈敏性，縮短了藥敏時(shí)間。采用該方法對從來源于臨床肺結(jié)核患者中分離的非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，討論自貢市非結(jié)核分枝桿菌耐藥情況。

1 材料與方法

1.1材料 收集自貢市2012年至2015年培養(yǎng)陽性的臨床菌株，并且經(jīng)hsp65、rpoB、ITS基因測序鑒定為非結(jié)核分枝桿菌的20株菌株。其中包括6株膿腫分枝桿菌、6株堪薩斯分枝桿菌、5株胞內(nèi)分枝桿菌和3株鳥分枝桿菌。實(shí)驗(yàn)中使用到的26種抗生素均購自美國Sigma公司，阿爾瑪藍(lán)購自美國伯樂公司，OADC增菌液購自美國Bection Dickinson公司。標(biāo)準(zhǔn)菌株95021由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法 藥敏試驗(yàn)采用微孔板阿爾瑪藍(lán)測定法(microplate Alamarue assay，MABA)，檢測對每種抗生素的MIC值[7-9]。26種抗生素分別為：氧氟沙星、利福平、異煙肼、阿米卡星、卷曲霉素、莫西沙星、加替沙星、左氧氟沙星、環(huán)絲氨酸、對氨基水楊酸、乙胺丁醇、鏈霉素、妥布霉素、利福噴丁、利福布丁、環(huán)丙沙星、利奈唑胺、司帕沙星、力克肺疾、氯法齊明、頭西、美羅培南、克拉霉素、米諾環(huán)素、復(fù)方新諾明、磺胺甲惡唑?？股匕凑彰绹R床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)溶解(見表1)，液體培養(yǎng)基為含5% OADC的用調(diào)過陽離子的MH肉湯(CAMHB)培養(yǎng)基[9]。

刮取羅氏培養(yǎng)基上處于生長對數(shù)期的菌株，與生理鹽水配成0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞舛?，?0 μL加入到10 mL含5% OADC的 CAMHB中，以制備最終接種液(菌體濃度約為5×105CFU/mL)，顛倒混勻。96孔板第一行加入無菌鹽水作為對照，第二排加入無藥物的培養(yǎng)基作對照。藥物濃度以2倍稀釋方式由高至低遞減。取稀釋好的菌液100 μL加入到每孔培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)。試驗(yàn)設(shè)立陰性對照和標(biāo)準(zhǔn)菌株對照。24 h后在第一孔無藥培養(yǎng)基中加入70 μL指示劑(20 μL阿爾瑪藍(lán)色和50 μL無菌5%吐溫- 80)，育24 h后如果培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，則在所有含藥培養(yǎng)基中加入指示劑，24 h后觀察結(jié)果；如果未變成紅色，則繼續(xù)在第二空中加入指示劑，培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，如果沒有變成紅色則重復(fù)此步驟，如果變?yōu)榧t色則在所有含藥培養(yǎng)基中均加入指示劑，24 h后觀察結(jié)果。變色孔最低濃度與不變色孔最高濃度所對應(yīng)的藥物濃度范圍為MIC值。將MIC值與藥物的判讀參考值(表1)進(jìn)行比較，判斷該菌株對該種藥物是否耐藥[9-11]。

2 結(jié) 果

23株非結(jié)核分枝桿菌的藥敏結(jié)果均在1周內(nèi)獲得MIC值，與藥物的判讀參考相比，獲得不同菌株對藥物的耐藥結(jié)果(表2)。其中23株非結(jié)核分枝桿菌對環(huán)絲氨酸、對氨基水楊酸、頭西、美羅培南、磺胺甲惡唑、異煙肼、卷曲霉素耐藥率為100%；對乙胺丁醇、力克肺疾、鏈霉素耐藥率為80%～95%；對氧氟沙星、利福平、耐藥率為70%；對利福噴丁、利福布丁、環(huán)丙沙星、利奈唑胺、司帕沙星、米諾環(huán)素、復(fù)方新諾明耐藥率為30%～55%；其余藥物低于25%。

比較藥敏結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種屬間對藥物的耐藥情況存在著種間差異。在26種藥物中，膿腫分枝桿菌對其中22種藥物耐藥、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌對其中的14種藥物耐藥、堪薩斯分枝桿菌對其中10種藥物耐藥。主要差異為氧氟沙星、利福平、米諾環(huán)素、復(fù)方新諾明為膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌耐藥及堪薩斯分枝桿菌敏感；莫西沙星、加替沙星、左氧氟沙星、利福噴丁、利福布丁、環(huán)丙沙星、利奈唑胺、司帕沙星為膿腫分枝桿菌耐藥，鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌敏感。

表1 抗生素濃度范圍及判斷標(biāo)準(zhǔn)

Tab.1 Concentration range of antibiotics and the judgment standard

抗生素濃度范圍(μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)菌株95021(μg/mL)最低抑菌濃度MIC(μg/mL)敏感(S)臨界值(I)耐藥(R)氧氟沙星64～0.03116～32--2利福平256～0.125>2565異煙肼256～0.125>256--1阿米卡星16～0.0084～8163264卷曲霉素16～0.008>16--2.5莫西沙星16～0.0084～8124加替沙星16～0.0082～4---左氧氟沙星16～0.008>16248環(huán)絲氨酸128～0.063128--50對氨基水楊酸64～0.031>64--2乙胺丁醇128～0.06332～645-10鏈霉素128～0.06364～1285-10妥布霉素64～0.0311～2248利福噴汀32～0.016>32---利福布丁32～0.01616～32--2環(huán)丙沙星32～0.0164～8124利奈唑胺64～0.03116～3281632司帕沙星16～0.0088～16---力克肺疾64～0.031>64---氯法齊明16～0.0080.25～0.5---頭西64～0.03132～641632～64128美羅培南64～0.031>6448～1632克拉霉素32～0.0160.25～0.5248米諾環(huán)素32～0.016>3212～416復(fù)方新諾明256～0.125>25638-76磺胺甲惡唑256～0.125>256---

表2 23株非結(jié)核分枝桿菌藥敏結(jié)果

Tab.2 Drug sensitivity test result of 23 strains of Mycobacterium tuberculosis

抗生素膿腫分枝桿菌(9株)鳥分枝桿菌(3株)胞內(nèi)分枝桿菌(5株)堪薩斯分枝桿菌(6株)耐藥(R)敏感(S)耐藥(R)敏感(S)耐藥(R)敏感(S)耐藥(R)敏感(S)氧氟沙星90305006利福平90305006異煙肼90305060阿米卡星18031424卷曲霉素90305060莫西沙星90030506表2(續(xù))抗生素膿腫分枝桿菌(9株)鳥分枝桿菌(3株)胞內(nèi)分枝桿菌(5株)堪薩斯分枝桿菌(6株)耐藥(R)敏感(S)耐藥(R)敏感(S)耐藥(R)敏感(S)耐藥(R)敏感(S)加替沙星63030506左氧氟沙星90030506環(huán)絲氨酸90305060對氨基水楊酸90305060乙胺丁醇90304142鏈霉素90304160妥布霉素18030506利福噴汀90030515利福布丁90030506環(huán)丙沙星90120506利奈唑胺90032306司帕沙星90030506力克肺疾90305042氯法齊明18030506頭西90305060美羅培南90305060克拉霉素18120506米諾環(huán)素81213206復(fù)方新諾明90214106磺胺甲惡唑90305060

3 討 論

非結(jié)核分枝桿菌廣泛存在于自然界的土壤，塵埃、水、魚類和家禽中。傳播途徑主要從環(huán)境中獲得感染，如污水等，而人與人之間的傳染極少見。最近幾次流調(diào)結(jié)果顯示非結(jié)核分枝桿菌肺病正呈逐年的增長趨勢。由于我國大部分地市級結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室并未開展非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定工作，因此常將非結(jié)核分枝桿菌病誤診為結(jié)核病進(jìn)行診治，極大的延誤了非結(jié)核分枝桿菌的臨床治療。由于比例法藥敏試驗(yàn)步驟繁瑣且耗時(shí)，不能及時(shí)獲得菌株的耐藥結(jié)果。本試驗(yàn)采用微孔板阿爾瑪藍(lán)測定法，共測定26種藥物的MIC值，對于非結(jié)核的臨床治療藥物選擇提供了更多的依據(jù)。

從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，非結(jié)核分枝桿菌對大部分結(jié)核類抗生素都耐藥，尤其對常用的抗結(jié)核藥物中的異煙肼、卷曲霉素、鏈霉素到達(dá)100%的耐藥率；對氧氟沙星、乙胺丁醇、利福平達(dá)到70%以上耐藥率。如果以結(jié)核分枝桿菌常規(guī)治療方法則對患者無明顯效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示自貢市非結(jié)核分枝桿菌對阿米卡星、妥布霉素、氯法齊明及克拉霉素基本敏感，與盛青等研究結(jié)果較為一致[12]。本實(shí)驗(yàn)共收集4種非結(jié)核分枝桿菌，其不同種對抗生素耐藥程度也不相同，其中膿腫分枝桿菌耐藥率達(dá)82.3%，鳥分枝桿菌與胞內(nèi)分枝桿菌達(dá)53%，堪薩斯分枝桿菌耐藥率最低為38%。每種分枝桿菌中的幾株非結(jié)核分枝桿菌對抗生素的耐藥情況基本一致，對不同藥物的耐藥與否，是不是該種的特性值得研究。當(dāng)然本次試驗(yàn)中由于菌種較少，后期將繼續(xù)收集菌株研究藥物的耐藥性與菌種的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)中采用微孔板阿爾瑪藍(lán)測定法測定非結(jié)核分枝桿菌的MIC值，該方法中采用液體培養(yǎng)基及使用阿爾瑪藍(lán)指示劑，因此藥敏時(shí)間大大的縮短。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)檢測了26種藥物的MIC值，對于臨床的治療指導(dǎo)具有重要的作用。由于非結(jié)核分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌在臨床的表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室痰檢結(jié)果極為一致，因此很難區(qū)分。對于非結(jié)核分枝桿菌肺病病原體應(yīng)該盡早鑒定并及時(shí)進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，才能對臨床治療提供重要的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

參考文獻(xiàn):

[1] Daley CL, Griffith DE,馬麗萍,等.肺部非結(jié)核分枝桿菌感染[J].國際結(jié)核病與肺部疾病雜志, 2011, 6(1): 3l-37.

[2] Kim JS, Tanaka N，Newell JD, et al. Nontuberculousmycobacterialinfecliun: CT scan findings, genotype,and treatment respon. siveness[J].Chest, 2005, 128: 3863-3869．

[3] 劉剛,王慶,闞曉紅,等.非結(jié)核分枝桿菌110株的耐藥性結(jié)果分析[J].中華結(jié)核和呼吸雜志, 2015, 35(8): 616-617.DOI: 10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2012.08.016.

[4] Thomson RM. NTM working group at Queensland TB control center and queenslandMycobactrialreference laboratory. Changing epidemiology of pulmonaryNontuberculousmycobacteriainfections[J]. Emerg Infect Dis,2010,16:1576-1583. DOI:10.3201/ eid1610.091201

[5] Griffith DE, Brown-Elliott BA, Langsjoen B, et al. Clinical and molecular analysis of macrolide resistance inMycobacteriumaviumcomplex lung dtsease[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2006, 174: 928-934. DOI:10.1164/rccm.200603-450OC

[6] Hernandez-Garduno E, Elwood RK. Demographic risk faclots of pulmonary colonization by non-tuberculousMycobacteria[J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2010, 14: 106-112

[7] 黃海榮,于霞,姜廣路,等.利奈唑胺對分枝桿菌體外抑菌作用的初步研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志, 2011, 34: 575-578. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2011.08.009

[8] 聶文娟, 段鴻飛, 黃海榮, 等.膿腫分枝桿菌菌種鑒定及藥物敏感試驗(yàn)研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志, 2014, 37: 517-521.DOI:10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2014.07.008

[9] CLSI. Susceptibility testing ofMycobacteria, nocardiae, and other aerobic actinomycetes; approved standard-Second Edition. CLSI document M24-A2[S]. Wayne: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2011.

[10] Agnieszka B, Heather J, Kate B, et al. Comparative drug resistance ofMycobacteriumabscessusandM.chelonaeisolates from patients with and without cystic fibrosis in the united kingdom [J]. J Clin Microbiol， 2013, 51(1):217-223.

[11] Li G, Lian LL, Wan L, et al. Antimicrobial susceptibility of standard strains of nontuberculousMycobacteriaby Microplate alamar blue assay[J]. PLoS One, 2013,8(12): e84065. DOI:10.1371/journal.pone.0084065

[12] 盛青,馬志明,譚俊豪,等.非結(jié)核分枝桿菌469株臨床藥敏結(jié)果分析[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 27(13): 2405-2407.DOI：10.3969/j.issn.1006-5725.2011.13.042