李健 許華 王兵 王勇強

天津市第一中心醫(yī)院重癥醫(yī)學科/天津市急救醫(yī)學研究所（天津 300192）

據(jù)統(tǒng)計，35%～59%的膿毒癥患者曾發(fā)生血小板減少，且其與生存率呈負相關，感染誘發(fā)的血小板減少癥（thrombocytopenia，TCP）是膿毒癥患者死亡的危險標志之一［1-3］。因此，及早發(fā)現(xiàn)并干預可能引起TCP的危險因素，及時恢復患者血小板低計數(shù)狀態(tài)是降低膿毒癥TCP患者病死率的關鍵所在。然而，目前關于膿毒癥TCP的發(fā)病機制尚未完全闡明，它與機體全身炎癥網(wǎng)絡效應、免疫功能障礙以及宿主對不同感染病原微生物及其毒素的異常反應密切相關［4］。白細胞介素?18（IL?18）是一種在體內(nèi)分布較為廣泛的促炎細胞因子，研究顯示IL?18能夠準確反映膿毒癥的嚴重程度并且與其預后密切相關［5-6］。而目前對IL?18在膿毒癥TCP患者中的表達情況以及其與血小板減少的相關性尚鮮見報道。本研究通過收集并檢測膿毒癥患者及膿毒癥TCP患者血清IL?18的表達水平及血小板計數(shù)和28 d生存率，初步探討IL?18與膿毒癥TCP的相關性及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年6月至2014年5月入住天津市第一中心醫(yī)院ICU的患者60例，其中膿毒癥患者32例，膿毒癥TCP患者28例。入選病例符合2001年國際膿毒癥會議關于膿毒癥診斷標準［7］，觀察期間兩次或以上住入ICU，只第一次列入觀察范圍。排除標準：惡性腫瘤；免疫系統(tǒng)疾病，造血系統(tǒng)嚴重損傷及惡性腫瘤；年齡＜14歲或＞75歲，心肺復蘇后，終末期肝或腎功能衰竭者，入院24 h內(nèi)死亡者。疾病的嚴重程度采用急性生理和慢性健康狀況評分Ⅱ（APACHEⅡ）進行評價。以外周血小板計數(shù)＜100×109/L至少2次作為血小板減少的標準。全部患者的細菌培養(yǎng)（痰液、血液、尿液、引流液）均為陽性。

本研究符合醫(yī)學倫理學標準，并經(jīng)天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會批準，所有治療方案均獲得患者家屬知情同意。

1.2 臨床指標觀察與檢測 于入院24 h內(nèi)取外周靜脈血，檢測血小板計數(shù)（PC）、全血白細胞計數(shù)（WBC）、C反應蛋白（CRP）及纖維蛋白原的表達情況。記錄APACHEⅡ評分、ICU住院時間、出血事件、感染位點及28 d病死率。

1.3 外周血中IL?18表達檢測 采用RT?PCR方法檢測外周血單個核細胞中IL?18 mRNA水平的表達，采用密度梯度離心法分離外周血中單個核細胞，提取細胞總RNA，并檢測RNA的純度和濃度，A260/A280值均在1.8～ 2.0之間。之后將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT?PCR引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成（具體序列見表1）。選用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa公司）試劑盒以及ABI PRISM?7500擴增儀進行RT?PCR反應。反應條件設定參照試劑盒說明書。每樣本設平行反應孔3個。以GAPDH為內(nèi)參，取平均Ct值計算2?△△Ct值，作為各樣本mRNA的相對表達量。

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測外周血中的IL?18，按照IL?18酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（NeoBioscience Tech?nology公司）說明書將血液樣本短暫離心并檢測。

表1 RT?PCR引物序列Tab.1 Sequences of primers for real time PCR

1.4 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。均數(shù)間差異統(tǒng)計學意義的檢驗采用t?test，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 膿毒癥患者32例，膿毒癥TCP患者28例，兩組患者性別、年齡、APACHEⅡ評分、WBC、CRP及纖維蛋白原等比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2；初次感染位點、感染源、器官損傷種類及數(shù)量差異亦無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表2 兩組患者臨床特征比較Tab.2 Clinical characteristics of patients ±s

表2 兩組患者臨床特征比較Tab.2 Clinical characteristics of patients ±s

注：與膿毒癥組比較，**P＜0.001

臨床特征性別（男/女）年齡（歲）APACHEⅡ評分（分）PC（× 109/L）WBC（× 109/L）CRP（mg/dL）纖維蛋白原（g/L）膿毒癥組16/16 63（23 ～ 82）23.9±6.8 124.35±63.41 11.80±1.76 9.4（3.0 ～ 29.8）4.8±1.2膿毒癥TCP組13/15 60（19 ～ 74）21.2±8.3 20.93±4.71**10.12±2.56 10（2.3 ～ 34.6）5.1±2.2

表3 兩組患者感染位點、器官損傷等基線情況比較Tab.3 Baseline characteristics of sepsis patients and severe sepsis patients with thrombocytopenia 例（%）

2.2 外周血單個核細胞中IL?18的表達 膿毒癥患者外周血單個核細胞中IL?18 mRNA的表達量高于膿毒癥TCP患者（P=0.015，圖1）；通過對兩組患者血清中IL?18含量的檢測，結(jié)果顯示膿毒癥患者血清中IL?18的含量高于膿毒癥TCP患者（P=0.034，圖2）。

圖1 兩組患者外周血單個核細胞中IL?18 mRNA的表達情況Fig.1 Expression levels of IL?18 mRNA in PBMCs of sepsis patients and severe sepsis patients with thrombocytopenia

圖2 兩組患者血清中IL?18的表達情況Fig.2 Plasma concentrations of IL?18 in sepsis patients and severe sepsis patients with thrombocytopenia

3 討論

膿毒癥是嚴重創(chuàng)傷、燒傷、休克、感染、大手術等臨床急、危重患者的嚴重并發(fā)癥之一，亦是誘發(fā)膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征的重要因素，嚴重威脅人類健康［8］。膿毒癥患者的TCP發(fā)生率較高，其血小板減少程度和持續(xù)時間在預測膿毒癥患者死亡率方面具有重要作用［9-10］。因此，明確膿毒癥TCP發(fā)病機制，針對性地糾正膿毒癥患者血小板的減少狀態(tài)是解決膿毒癥高死亡率的難點之一。然而目前有關膿毒癥相關TCP的發(fā)病機制尚未明確。本研究檢測了IL?18在膿毒癥及其相關TCP患者中的表達情況，為探討膿毒癥相關TCP的發(fā)病機制提供臨床檢測數(shù)據(jù)。

IL?18是一種在體內(nèi)分布較為廣泛的促炎癥細胞因子，可促進INF?γ的產(chǎn)生，在感染及炎癥的起始免疫反應中具有重要調(diào)控作用［11］。研究顯示IL?18直接與膿毒癥患者的死亡率相關，血漿中IL?18的水平可作為膿毒癥患者不良預后的指標，且獨立于其他免疫因子尤其是 IL?1β［5］；與此相符，ENDO等［12］檢測13例膿毒癥患者的血清IL?18水平，發(fā)現(xiàn)其與膿毒癥APACHEⅡ評分類似，能夠準確反映疾病的嚴重程度；OBERHOLZER等［13］則進一步發(fā)現(xiàn)IL?18在膿毒癥患者中明顯升高，死亡的膿毒癥患者和膿毒癥休克患者的IL?18水平比存活者和無休克的膿毒癥患者的水平高；孫榮青等［14］檢測ICU膿毒癥患者的前3天IL?18水平結(jié)果同樣顯示：升高的IL?18水平與膿毒癥患者疾病嚴重程度及預后密切相關。由此可見，IL?18與膿毒癥患者疾病嚴重程度及預后密切相關。然而關于IL?18與血小板減少的相關性鮮見報道，在本研究中，筆者收集并檢測了60例膿毒癥患者及膿毒癥TCP患者外周血單個核細胞中IL?18 mRNA的表達以及血清中IL?18的表達情況，結(jié)果顯示IL?18在膿毒癥TCP患者中的表達水平高于膿毒癥患者（P=0.015，P=0.034）。結(jié)合兩組患者臨床特征及基線情況，可見IL?18與膿毒癥患者血小板減少程度呈負相關，與膿毒癥患者疾病程度呈正相關。該結(jié)果不僅驗證了前人所報道的IL?18與膿毒癥患者的病情嚴重程度及預后密切相關，還證實了IL?18與膿毒癥患者中血小板減少程度相關，揭示了IL?18與膿毒癥TCP患者的病情嚴重程度的相關性，具有一定的臨床意義，然而本研究僅處于初步探索階段，對于IL?18是否參與膿毒癥TCP的發(fā)病過程及其可能的機制仍需進一步深入的研究。

IL?1β是IL?1家族的主要成員并且以往研究顯示，IL?1β 在膿毒癥中扮演著重要的角色：IL?1β在血小板內(nèi)存在自分泌環(huán)路，在LPS刺激下該分泌方式是血小板級聯(lián)活化的必須因素并被視為一種可促進血栓形成的血小板興奮劑［15］；并且研究還指出IL?1α和IL?1β能夠作為TLR4的內(nèi)生性配體通過侵入并激活LPS結(jié)扎的TLR4信號通路而產(chǎn)生無菌炎癥［15］。最新研究報道顯示與IL?1β同屬于IL?1家族并且活化都依賴于Caspase?1炎性小體的IL?18在腎功能障礙患者中的產(chǎn)生與激活均依賴于TLR4信號通路，并且IL?18能夠促進TLR4的表達及活性氧（ROS）的產(chǎn)生，而ROS能夠刺激NLRP3進而促進炎性小體的形成，由NLRP3、ASC和Caspase?1形成的炎性小體又可以激活IL?18前體［16-21］。此外研究還報道血小板也能夠獨自合成剪切和釋放IL?18，并且報道揭示在人體血液中的IL?18大都來源于血小板［22］。因此，筆者推測IL?18很有可能在血小板內(nèi)也存在自分泌環(huán)路，并且參與膿毒癥相關TCP的發(fā)病過程。然而其具體的分子機制仍有待進一步研究驗證。

參考文獻

［1］VANDIJCK D M，BLOT S I，DE WAELE J J，et al.Thrombo?cytopenia and outcome in critically ill patients with bloodstream infection［J］.Heart Lung，2010，39（1）：21?26.

［2］XU R，LIN F，BAO C，et al.Complement 5a receptor?mediat?ed neutrophil dysfunction is associated with a poor outcome in sepsis［J］.Cell Mol Immunol，2016，13（1）：103?109.

［3］LI M F，LI X L，F(xiàn)AN K L，et al.Platelet desialylation is a novel mechanism and a therapeutic target in thrombocytopenia during sepsis：an open ?label，multicenter，randomized con?trolled trial［J］.J Hematol Oncol，2017，10（1）：104.

［4］VASSILIOU A G，MASTORA Z，ORFANOS S E，et al.Elevat?ed biomarkers of endothelial dysfunction/activation at ICU ad?mission are associated with sepsis development［J］.Cytokine，2014，69（2）：240?247.

［5］EIDT M V，NUNES F B，PEDRAZZA L，et al.Biochemical and inflammatory aspects in patients with severe sepsis and sep?tic shock：The predictive role of IL?18 in mortality［J］.Clin Chim Acta，2016，453：100?106.

［6］OKUHARA Y，YOKOE S，IWASAKU T，et al.Interleukin?18 gene deletion protects against sepsis?induced cardiac dysfunc?tion by inhibiting PP2A activity［J］.Int J Cardiol，2017，243：396?403.

［7］2001年國際膿毒癥定義會議關于膿毒癥診斷的新標準［J］.中國危重病急救醫(yī)學，2006，18（11）：645.

［8］王勇強，王兵.膿毒癥的診治［J］.中華急診醫(yī)學雜志，2013，22（2）：222?224.

［9］VENKATA C，KASHYAP R，F(xiàn)ARMER J C，et al.Thrombocy?topenia in adult patients with sepsis：incidence，risk factors，and its association with clinical outcome［J］.J Intensive Care，2013，1（1）：9.

［10］ 彭錦，方偉強，蔡舉瑜，等.靜脈注射免疫球蛋白輔助治療膿毒癥相關性血小板減少癥的療效［J］.實用醫(yī)學雜志，2015，31（18）：3072?3074.

［11］ KWAK A，LEE Y，KIM H，et al.Intracellular interleukin（IL）?1 family cytokine processing enzyme［J］.Arch Pharm Res，2016，39（11）：1556?1564.

［12］ ENDO S，INADA K，YAMADA Y，et al.Interleukin 18（IL?18）levels in patients with sepsis［J］.J Med，2000，31（1?2）：15?20.

［13］ OBERHOLZER A，STECKHOLZER U，KURIMOTO M，et al.IL?18 plasma levels are increased in patients with sepsis com?paredtosevereinjuredpatients［J］.Shock，2001，16（6）：411?414.

［14］ 孫榮青，張少雷.膿毒癥早期血清白細胞介素?18和10在疾病嚴重程度及預后評估中的價值研究［J］.中國危重病急救醫(yī)學，2011，5：299?301.

［15］ BROWN G T，NARAYANAN P，LI W，et al.Lipopolysaccha?ride stimulates platelets through an IL?1β autocrine loop［J］.J Immunol，2013，191（10）：5196?203

［16］ KWAK A，LEE Y，KIM H，et al.Intracellular interleukin（IL）?1 family cytokine processing enzyme［J］.Arch Pharm Res，2016，39（11）：1556?1564.

［17］ RHEE A C，CAIN A L，HILE K L，et al.IL?18 activation is dependent on Toll?like receptor4 during renal obstruction［J］.J Surg Res，2013，183（1）：278?284.

［18］ MELDRUM K K，ZHANG H，HILE K L，et al.Profibrotic effect of Interleukin?18 in HK?2 cells is dependent on stimula?tion of the Toll?like receptor 4（TLR4）promoter and increased TLR4 expression［J］.J Biol Chem，2012，287（48）：40391?40399.

［19］ DIAS?MELICIO L A，F(xiàn)ERNANDES R K，RODRIGUES D R，et al.Interleukin?18 increases TLR4 and mannose receptor ex?pression and modulates cytokine production in human monocytes［J］.Mediators Inflamm，2015，2015：236839.

［20］ WYNN J L，WILSON C S，HAWIGER J，et al.Targeting IL?17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL?18［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2016，113（19）：E2627?2635.

［21］ WANG W，WU Q H，SUI Y，et al.Rutin protects endothelial dysfunction by disturbing Nox4 and ROS?sensitive NLRP3 in?flammasome［J］.Biomed Pharmacother，2017，86：32?40.

［22］ ALLAM O，SAMARANI S，JENABIAN M A.et al.Differential synthesis and release of IL?18 and IL?18 Binding Protein from human platelets and theirimplications for HIV infection［J］.Cy?tokine，2017，90：144?154.